디지털 물방울 PCR은 정량적 PCR에 비해 향상된 정확도와 감도를 부여합니다. 이것은 최소한의 장비와 전문 지식이 필요하지 않은 디지털 물방울 PCR을위한 간단한 방법입니다. 입자 템플릿 유화제는 특수 장비가 필요하지 않은 미세유체가 없는 유화 방법입니다.
또한 유화는 몇 초 동안 발생하고 컨테이너 볼륨으로 확장됩니다. 상업용 구슬의 경우, 입자 템플릿 유화제 또는 PTE와 호환되는 말린 폴리 아크릴아미드 입자 0.5 그램을 50 밀리리터 원추형 튜브에 멸균 수의 30 밀리리터에 넣고 잘 섞는다. 실온에서 30분 동안 배양하세요.
구슬의 미세유체 제작을 위해 3인치 실리콘 웨이퍼 중앙에 1밀리리터의 포토레지스트를 붓고 500 RPM에서 30초 동안 회전한 다음 1250 RPM을 30초 동안 회전시합니다. 웨이퍼를 섭씨 95도로 설정된 핫플레이트에 15분간 놓아 용매를 증발시다. 커버 글래스 슬라이드로 실리콘 웨이퍼에 포토마스크를 고정하고 2.5분 동안 데이터 로퍼를 부착합니다.
웨이퍼를 섭씨 95도로 설정한 핫플레이트에 5분간 놓아 포스트 노출 베이킹을 합니다. 최대 100% PGMEA의 욕조에 15분 동안 담그어 포토레지스트 실리콘 웨이퍼를 개발합니다. 100% PGMEA의 신선한 웨이퍼를 헹구고 100%의 이소프로파놀이 그 뒤를 따릅니다.
웨이퍼를 공기 건조한 다음 1분간 섭씨 95도로 설정된 핫플레이트에 말리고 깨끗한 3인치 페트리 접시에 넣습니다. PDMS 실리콘 베이스와 경화 시약을 10:1 비율로 혼합한 다음, 기포가 관찰될 때까지 진공 하에서 건조기 아래를 사용하여 혼합 PDMS를 분해합니다. 페트리 접시에 탈가스 PDMS를 부어 실리콘 웨이퍼가 완전히 침수되도록 합니다.
실리콘 웨이퍼와 PDMS를 탈가스한 다음 실리콘 웨이퍼를 60분 이상 섭씨 65도로 설정된 오븐에 배치하여 PDMS를 치료합니다. 메스를 사용하여 페트리 접시의 미세 유체 특징을 포함하는 PDMS 블록을 소비합니다. 0.75밀리미터 생검 펀치를 사용하여 입구와 콘센트를 PDMS 블록에 넣습니다.
그런 다음 반복적인 적용을 통해 먼지와 미립자를 제거하고 블록 표면에 포장 테이프를 제거합니다. 유리 슬라이드를 100% 이소프로판올로 헹구고 그 후 표면을 공기 건조시켜 청소하십시오. 플라즈마는 플라즈마 본더를 사용하여 1 분 동안 산소 플라즈마1 밀리바르로 유리 슬라이드와 PDMS를 모두 처리합니다.
플라즈마 처리 된 PDMS를 유리 슬라이드에 아래로 향한 특징을 배치하여 PDMS를 유리 슬라이드에 부착하고 플라즈마 처리 측이 위로 향합니다. 슬라이드를 섭씨 65도로 설정하여 최소 30분간 오븐에 넣고 본딩을 완료합니다. 모든 미세 유체 채널을 불소 표면 처리로 처리하여 표면 소수성을 보장한 다음 장치를 섭씨 65도에서 적어도 10분 동안 굽습니다.
폴리아크릴아미드 또는 PAA, 및 하이드로플루오로에터 또는 HFE를 주사기 펌프에 용액 함유 주사기를 모두 로드합니다. 폴리에틸렌 튜브를 사용하여 두 주사기를 미세 유체 장치에 연결합니다. 낙하 생성 장치를 실행하고 15 밀리리터 수집 튜브에서 방울의 1 밀리리터를 수집한 다음 중합을 위해 실온에서 3 시간 동안 배양하십시오.
인큐베이션 후, 파이펫팅하여 오일의 하부 층을 제거합니다. HFE 오일에 20%PFO의 1밀리리터를 15밀리리터 수집 튜브에 화학 적물화기로 추가합니다. 혼합 후 15밀리리터 컬렉션 튜브를 2000 x g로 2분간 회전합니다.
파이펫팅으로 아래쪽 레이어를 제거하고 프로세스를 한 번 더 반복합니다. 육산에 2%의 소르비탄 모노올레아테를 넣고 15밀리리터 수집 튜브에 넣고 소용돌이를 피하십시오. 튜브를 3000 x g에서 3분간 회전시키고 파이펫팅하여 계면활성제 용액을 제거하여 상체를 제거합니다.
이 것을 두 번 반복합니다. TEBST 버퍼 5밀리리터를 넣고 잘 섞은 다음 3분 동안 3000 x g로 회전하고 파이펫팅으로 상퍼를 제거합니다. 이 세 번 반복한 다음 TEBST의 5 밀리리터로 다시 중단합니다.
입자를 펠릿하기 위해 6000 x g에서 원심분리하여 입자 템플릿 에뮬레이션을 위해 폴리 아크릴아미드 입자를 준비합니다. 그런 다음 피펫팅으로 상체를 제거하고 멸균 물에 펠릿을 다시 분리합니다. 잔류 TEBST를 제거하기 위해 세 번 반복합니다.
텍스트 원고에 설명된 바와 같이 PCR 마스터 믹스, 적절한 프라이머 및 형광석 가수 분해 프로브를 사용하여 신선한 15 밀리리터 원심분리기 튜브에서 분산 단계를 준비합니다. 튜브 회전기사용으로 부드러운 동요 아래 실온에서 5분간 배양합니다. 분산 단계는 6000 x g에서 1분 동안 원심분리하고 상체를 제거합니다.
사카로미세스 세레비시아게 게놈 DNA 1개를 펠릿에 넣고 파이펫팅이나 격렬한 태핑으로 철저히 섞는다. 유화를 위해 HFE 오일에 2%의 불소 활성제 200마이크로리터를 튜브에 추가합니다. 튜브를 피펫팅하거나 눌러 펠릿을 빼내고 3000 RPM에서 30초 동안 소용돌이를 피냅니다.
에멀젼이 1분 동안 정착한 다음, 하단 오일 상의 100마이크로리터를 제거하고 이 부피를 HFE 오일의 신선한 2% 불소 활성제로 대체합니다. 튜브를 여러 번 부드럽게 반전하여 혼합합니다. 작은 위성 물방울이 제거될 때까지 세 번 이상 반복합니다.
2~5분 간 정착한 후, 바닥 오일 상을 제거합니다. 이 부피를 불소 탄소 오일의 5%불소 활성제로 대체하십시오. 200 마이크로리터 PCR 튜브에 샘플의 파이펫 100 마이크로리터, 그리고 열 사이클러에 PCR 튜브를 배치합니다.
형광 이미징을 위한 카운트 슬라이드에 샘플을 피펫하고 샘플을 이미지합니다. 입자 템플릿 유화는 뛰어난 단백성을 부여합니다. 과잉 상체가 제거됨에 따라 안정화 계면활성제가 첨가되고, 샘플은 에멀젼을 생성하기 위해 소용돌이된다.
결과 물방울은 반응에 필요한 시약 및 시료 분자 또는 세포를 포함하는 입자 코어 및 수성 샘플로 구성됩니다. 측동기 입자가 있는 다분산 된 물방울은 충분한 소용돌이를 나타냅니다. 또 다른 문제는 캡슐화 효율을 낮추는 과도한 위성의 생성입니다.
위성은 캡슐화된 전체 샘플 볼륨의 10% 이상을 차지하지 않아야 합니다. 신선한 오일로 세척하여 에멀젼에서 지울 수 있습니다. 증폭된 표적을 함유한 액적들이 형광이 될 때 PTE의 유용성은 디지털 PCR에서 입증될 수 있어 표적의 직접적인 양을 허용합니다.
형광액은 대상이 드물때 몇 가지 긍정을 산출하고, 풍부할 때 많은 양수를 산출합니다. 이러한 결과는 시판되는 폴리아크릴아미드 입자를 사용하여 반복가능하여 동일한 범위에서 정확한 측정을 달성합니다. 분산 단계에서 상체를 제거하는 것은 샘플 캡슐화에 중요합니다.
펠릿과 상체체의 부피를 알면 둘 사이의 인터페이스를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 의심스러울 때, 상체를 제거하는 측면에서 잘못.
