يوفر سير عمل تشريح وتحليل التركيب الكامل هذا نهجا جديدا لتحليل مورفولوجيا مورفولوجيا الأعصاب الفردية للذوق ، وتحويل أرقام أنواع الخلايا ، والعلاقات الفيزيائية بين الخلايا. جمع الظهارة اللغوية بأكملها يسمح لنا لقياس العدد المطلق للخلايا وحجم التدين داخل برعم الذوق كله. وهذا النهج أكثر دقة من تقديرات بنية الخلية استنادا إلى أخذ العينات من الأقسام، مما يقلل من التباين التقني.
هذا هو أيضا الأسلوب الأول الذي يقدم تحليلا مفصلا للخلايا برعم الذوق فيما يتعلق ال الداخلي بهم. يمكن لهذه الطريقة تعزيز التحقيقات في الدوائر المحتملة داخل برعم الذوق ، وكذلك عمليات المرض والعلاج الكيميائي التي تعطل وظيفة الذوق الطبيعي. في معظم هذه الحالات، من غير الواضح ما هو الهيكل أو العلاقة التي يتم تعطيلها، لذلك فإن الحفاظ على كل هذه العوامل سليمة يسمح بجميع التحليلات ضمن إعداد واحد.
الخطأ الأكثر شيوعا هو محاولة تجنب إتلاف الظهارة عن طريق عدم تشريح قريبة بما فيه الكفاية إلى الجانب السفلي من الظهارة. من الضروري إزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة الأساسية قبل تجميد الأنسجة في قالب الأنسجة. من المهم أيضا التأكد من وضع الظهارة مسطحة في الجزء السفلي من قالب الأنسجة.
تبدأ عن طريق ذوبان وشطف اللسان في 0.1 ضرس الفوسفات العازلة. ثم ضع 1/2 من اللسان الأمامي الذي يحتوي على الحليمة الفطرية على شريحة زجاجية تحت مجهر تشريح. استخدم ملقط حاد ومقص تشريح لإزالة العضلات وإبقاء الأنسجة مفتوحة كما هو منحني الظهارة اللغوية، وضمان اتجاه مسطح من الأنسجة عن طريق الحفاظ على ريش مقص تشريح الخشنة موازية للظهارة.
تجاهل البطينية غير الكيراتينية ظهارة اللسان لأنه لا يحتوي على براعم الذوق. ثم استخدم مقص تشريح دقيق لتشريح أقرب إلى الجانب السفلي من الظهارة الكيراتينية. استخدام ملقط حادة انتهت لوضع قطعة من الظهارة في قالب الأنسجة وضمان أنه يضع شقة.
ثم إضافة قطرة من مركب درجة حرارة القطع الأمثل، أو أكتوبر، إلى الأنسجة. ضع قالب الأنسجة على قاعدة معدنية مبردة سابقا تحت نطاق التشريح ، ثم استمر في النقر على الأنسجة بخفة مع ملقط حتى يتم تجميد OCT ، مما يضمن تجميد الأنسجة مسطحة قدر الإمكان. مرة واحدة وقد جمدت أكتوبر، إضافة بسرعة أكتوبر إضافية ووضع القالب في كوب من المبردة 2-ميثيلبوتان حتى المجمدة.
جبل القالب أكتوبر على cryostat وقطع عليه إلى 20 ميكرون أقسام. جمع كل قسم وعرضه تحت المجهر الخفيف لتقييم قربها من قاعدة الظهارة. بعد حلق الأنسجة من الجانب السفلي من الظهارة ، قم بإذابة الظهارة وشطفها مرتين في 0.1 ضرس PB على شاكر.
قطع الحنك الصلب الأمامي إلى تقاطع الحنك الرخو والهلب ، ثم فصل الحنك الرخو عن الأنسجة الأساسية ، والتأكد من قطع أي شظايا عظمية متبقية وإزالة العضلات الإضافية والأنسجة الضامة. عقد الحنك مع ملقط حادة وإزالة الغدد المتبقية وتفقد النسيج الضام عن طريق كشط بلطف لهم مع شفرة حلاقة. ووصفت براعم الذوق كله وجميع التعصيب برعم الذوق في الفئران Phox2b-Cre TdTomato عن طريق تلطيخ الظهارة اللغوية مع الأجسام المضادة لDsRed والكيراتين ثمانية.
تم قياس حجم برعم الذوق وكشف عن عدم وجود ارتباطات بين أحجام برعم الذوق وأحجام التدبير في مناطق القياس سواء في شكل فطري أو محيط. إدارة جرعة منخفضة من تاموكسيفين في الفئران TrkB CreER TdTomato يسبب إعادة دمج الجينات ووضع العلامات على عدد قليل من الخلايا العصبية. ويظهر هنا برعم طعم كامل جبل ملطخة علامات الخلية تحويل الذوق anhydrase الكربونية أربعة وفوسفوليباز C بيتا اثنين.
يحتوي برعم الذوق هذا على اثنين من أربور المحطة الطرفية المسماة ، والتي تظهر مع إزالة برعم الذوق بعد إعادة بناء الألياف. باستخدام برنامج التصوير القائم على بكسل الخلية لتحديد القرب الأقرب بين الألياف العصبية وخلايا تحويل الذوق كشفت أنه من أصل 19 خلايا تحويل الذوق، وكان أربور المحطة الزرقاء ضمن 200 نانومتر من الأنهيدراز الكربوني الأزرق الفاتح أربعة زائد الخلية. يظهر أربور المحطة المرتبطة تتبع الخضراء في أرجواني ويقع ضمن 200 نانومتر من كل من الأنهيدراز الكربوني الفاتح والأزرق الداكن أربعة زائد الخلايا.
كامل جبل الكيراتين ثمانية و 5-إيثيل-2'deoxyuridine أو EdU تلطيخ براعم الذوق الفطرية كشفت أن الخلايا المسماة EdU كانت موجودة داخل وخارج براعم الذوق. ويلاحظ أرجواني والنوى الأرجواني خارج الكيراتين ثمانية بالإضافة إلى الحدود من برعم الذوق. كانت الخلايا الصفراء والبط البرية والزرقاء داخل برعم الذوق.
عند محاولة هذا البروتوكول، تشريح الأنسجة وتجميد الخطوات هي محورية. يمكن اتباع طرق تشريح الأنسجة هذه عن طريق تلطيخ مجموعة متنوعة من الخلايا والهياكل لتحليل العلاقات داخل برعم الذوق وخارج برعم الذوق ، ولكن داخل الحليمة. هذا هو التحليل الأول من أربور الذوق كله داخل برعم الذوق، فضلا عن علاقاتهم مع خلايا تحويل الذوق.
إن الحفاظ على العديد من هذه العناصر وتلطيخها في إعداد واحد يوسع إمكانيات التحليل ويصقل القياسات الممكنة.
