ويهدف البروتوكول إلى محاكاة الظروف الحية لانحطاط القرص الفقري للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية دون الحاجة إلى نماذج حيوانية. بالمقارنة مع زراعة الخلايا المختبرية ، تحافظ تقنية زراعة الأعضاء المفاعل الحيوي على الخلايا في بيئتها البيولوجية والميكانية الحيوية الأصلية بالإضافة إلى توفير حالة ثقافة قابلة للتحكم والتكرار. تبدأ مع شطف ذيل البقرة بأكملها جيدا مع مياه الصنبور لإزالة الأوساخ والشعر على السطح، ثم تزج الذيل في محلول بيتادين 1٪ لمدة 10 دقائق لتطهير السطح.
استخدم مشرط رقم 20 لإزالة الأنسجة الرخوة من العمود الفقري caudal لتسهيل التعرف على الأقراص الفقرية، أو IVDs. إزالة العمليات الشوكية والعرضية للفقرات مع plier إزالة العظام. قطع عرضا مع كماشة العظام من خلال منتصف كل جسم فقري للحصول على شرائح الحركة الفردية، ثم وضع شرائح الحركة التي تم جمعها في طبق بيتري مع شاش مبللة في محلول رينغر.
حدد موقع IVD في الفقرات عن طريق تحريك أجزاء الحركة بلطف ، ثم حدد موقع لوحة النمو عن طريق لمس والعثور على الجانب الحراري من لوحة النهاية العظمية. تبريد شفرة منشار مع الحل رينغر واستخدامه لإجراء اثنين من التخفيضات موازية في لوحة النمو من IVDs، واحد على كل جانب. نقل IVDs إلى طبق بيتري نظيفة مع الشاش نظيفة مبللة مع الحل رينغر.
كشط قبالة الجسم الفقري ولوحة النمو باستخدام شفرة مشرط، وترك لوحة نهاية سليمة. ضع السطحين مسطحين ومتوازيين لإجراء التحميل ونقل IVDs المكشطة إلى طبق بيتري طازج مع شاش مبلل بمحلول Ringer. قياس ارتفاع القرص وقطره مع الفرجار، ثم تنظيف جلطات الدم في عظم الفقرات مع محلول رينغر باستخدام نظام المرحاض النفاث.
تطهير IVDs في برنامج تلفزيوني و 10٪ بكتيريا البنسلين مع اهتزاز لمدة 15 دقيقة. شطف قبالة المضادات الحيوية عالية التركيز مع برنامج تلفزيوني و 1٪ ستريبتوميسين البنسلين. نقل الأقراص إلى غرف IVD التي تحتوي على خمسة ملليلتر من متوسط ثقافة IVD ووضعها في نظام المفاعل الحيوي مع حاضنة في 37 درجة مئوية مع 85٪ رطوبة و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
زراعة الأقراص لمدة أربعة أيام داخل نظام المفاعل الحيوي من خلال الحفاظ على ظروف تحميل مختلفة وفقا للمجموعات التجريبية. في مجموعة المراقبة الفسيولوجية، والثقافة IVDs مع متوسط الجلوكوز عالية باستخدام بروتوكول التحميل من 0.02 إلى 0.2 megapascals و 0.2 هيرتز لمدة ساعتين في اليوم الواحد. في المجموعة المرضية ، والثقافة IVDs مع متوسط الجلوكوز منخفضة باستخدام بروتوكول التحميل من 0.32 إلى 0.5 megapascals وخمسة هيرتز لمدة ساعتين في اليوم الواحد.
بين إجراءات التحميل، ضع IVDs في لوحات من ست آبار مع سبعة ملليلتر من وسيط ثقافة IVD لاسترداد التورم الحر. قياس ارتفاع القرص يوميا مع الفرجار بعد فترة تورم الحرة وبعد التحميل الديناميكي لمدة تجريبية. بعد دورة التحميل الديناميكية الأولى في اليوم الأول ، ضع IVDs مباشرة في طبق بيتري في وضع عمودي واستقرارها بملاقط.
حقن TNF-ألفا المؤتلف مع إبرة الأنسولين 30 قياس ببطء بسرعة حوالي 70 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة في IVDs من المجموعة المرضية. بعد الحقن، سحب الحقنة في منتصف الطريق إلى الوراء وسحب المكبس لخلق فراغ يمنع الحل المحقون من التسرب، ثم إزالة الحقنة تماما من IVD. تسبب التحميل التنكسية جنبا إلى جنب مع إمدادات التغذية المحدودة وحقن TNF-ألفا زيادة كبيرة في التعبير الجيني للعلامات المؤيدة للالتهابات interleukin ستة وinterleukin ثمانية في الأنسجة NP بعد أربعة أيام من الثقافة.
أظهر إطلاق البروتين ثمانية interleukin في المتوسطة المكيفة زيادة ملحوظة في المجموعة المرضية في اليوم الثاني واليوم الرابع. كان انخفاض ارتفاع القرص بعد التحميل أعلى في المجموعة المرضية مقارنة بالمجموعة الفسيولوجية ، وكانت الاختلافات أكثر وضوحا بعد اليومين و3 مقارنة باليوم الأول ، مما يشير إلى تأثير تدريجي للظروف التنكسية والالتهابية. تقنية تشريح موحدة مهم لنماذج الثقافة IVD كامل الجهاز القابلة للاستنساخ.
مطلوب مفاعل حيوي لتطبيق التحميل الفسيولوجي والتنكسية على IVDs لمحاكاة مختلف في ظروف الحيوية الحيوية في الجسم الحي. ويمكن تطبيق هذه التقنية على النباتات الوريدية البشرية التي هي ذات أهمية سريرية عالية. إنه نموذج جديد قبل السريرية لتطوير علاجات فعالة على انحطاط القرص في مرحلة مبكرة.
