تلخص الطبقات الأحادية المشتقة من المواد العضوية وظيفة الحاجز الظهاري المعوي للمريض وتسمح باختبار تأثير العلاجات التي تهدف إلى تعزيز الخلل الوظيفي في كل مريض لتحديد استراتيجيات العلاج الشخصية. توفر الطبقات الأحادية العضوية الوصول إلى الجانب القمي من الظهارة ، وهو الجانب الذي يحدث فيه الضرر ، وهو أمر طبيعي ويمكن الوصول إليه في المواد العضوية التي تنمو كهياكل 3D. كل عضوي مختلف ، وبالتالي الصراع.
لتشكيل طبقات أحادية ضيقة ، استخدم المواد العضوية في مرحلة الانتشار وهضمها بسرعة لتشكيل مجموعات من خليتين إلى أربع خلايا. معايرة بذر الخلايا لكل نموذج. سيتم عرض الإجراء من قبل Wies Van Dooremalen ، وهو باحث مشارك أول في HUB.
ابدأ بطلاء إدراج الغشاء بمصفوفة خارج الخلية أو ECM. من خلال العمل في خزانة السلامة الأحيائية ، ضع الغشاء في لوحة الدعم. قم بتخفيف ECM 40X في DPBS البارد مع الكالسيوم والمغنيسيوم ، ثم قم بماصة 150 ميكرولتر من ECM المخفف في المقصورة القمية لكل إدراج.
احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. لإعداد الخلايا للبذر ، قم بتسخين أليكوت من كاشف تفكك الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية. استخدم ملليلترين من الكاشف لكل بئر من صفيحة من ستة آبار.
انقل لوحة الاستزراع التي تحتوي على المواد العضوية من الحاضنة إلى خزانة السلامة الأحيائية. قم بمعالجة المواد العضوية كما هو موضح في مخطوطة النص ، ولكن لا تجمع أنابيب متعددة في أنبوب واحد. بعد حصاد المواد العضوية ، أضف الوسط القاعدي أو BM إلى 12 ملليلتر وأجهزة الطرد المركزي عند 85 مرة G ، ثم استنشق supernatant.
املأ الأنبوب الذي يحتوي على المواد العضوية بما يصل إلى 12 ملليلتر من DPBS ، ثم قم بماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات باستخدام ماصة 10 ملليلتر. جهاز طرد مركزي بسرعة 85 مرة G لمدة خمس دقائق عند ثماني درجات مئوية وشفط السوبرناتانت دون إزعاج الكريات العضوية. أضف كاشف تفكك الخلايا الذي تم تسخينه مسبقا إلى المواد العضوية وأعد تعليقها ، ثم احتضن الأنابيب قطريا أو أفقيا لمدة خمس دقائق في الحمام المائي عند 37 درجة مئوية.
بعد الحضانة ، ماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات باستخدام ماصة بلاستيكية معقمة سعة خمسة ملليلتر أو ماصة P1000. تحقق من التعليق العضوي تحت المجهر لمعرفة ما إذا كان قد تشكل خليط من الخلايا المفردة وبعض كتل الخلايا التي تتكون من خليتين إلى أربع خلايا. أوقف تفكك الخلايا عن طريق إضافة ما يصل إلى 12 ملليلتر من BM مع مثبط ROCK إلى تعليق الخلية.
الطرد المركزي للخلايا، ثم شفط supernatant دون إزعاج بيليه الخلية. عند التعامل مع نفس الثقافة العضوية في عدة أنابيب ، قم بتجميع كريات الخلايا قبل تعليقها في 12 ملليلتر من BM. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة 40 ميكرومتر مبللة مسبقا ب BM وحصاد التدفق في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر ، ثم اغسل المصفاة ب 10 ملليلتر من BM وحصاد التدفق في نفس الأنبوب. انقل تعليق الخلية المتوترة إلى أنبوبين مخروطيين جديدين سعة 15 ملليلتر وكرر الطرد المركزي.
شفط supernatant دون إزعاج بيليه الخلية وإعادة تعليق الخلايا في أربعة ملليلتر من IEM تستكمل مع 10 مثبطات ROCK micromolar لكل لوحة ثقافة كاملة تستخدم كمواد أولية. امزج كمية صغيرة من تعليق الخلايا بنسبة واحد إلى واحد مع Trypan Blue للعد ، ثم عد الخلايا واحسب العدد الإجمالي للخلايا الحية ، مع حساب كل خلية فردية في كتل صغيرة. قم بإعداد تعليق خلوي يحتوي على 3X 10 إلى الخلايا الحية السادسة لكل ملليلتر من IEM مع استكمال 10 مثبطات ROCK micromolar.
لزرع الخلايا ، قم بشفط DPBS بعناية من الإدخالات المغلفة ب ECM ، مع الحفاظ على اللوحة أفقية. ماصة 800 ميكرولتر من IEM مكملة بمثبط ROCK في كل حجرة بازوجانبية و 150 ميكرولتر من تعليق الخلية المحضر على الغشاء المطلي ب ECM في المقصورة القمية قطرة. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بمجرد أن ترسب الخلايا على الغشاء ، قم بقياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارية أو TEER كل يوم وصور الغشاء الذي يدرجه باستخدام المجهر. لتحديث الطبقات الأحادية ، قم بإزالة الوسط من المقصورات القاعدية الجانبية للصفيحة التي تحتوي على إدراج الغشاء ، ثم قم بشفط الوسط بعناية من المقصورات القمي. أضف 150 ميكرولتر من IEM الطازج إلى كل حجرة قمية وأضف 800 ميكرولتر من IEM الطازج إلى كل حجرة بازوجانبية.
إذا كنت تستخدم مقياس TEER يدوي ، فقم بتنظيف القطب الكهربائي باستخدام 70٪ من الإيثانول واتركه يجف في الهواء داخل خزانة السلامة البيولوجية ، ثم ضع القطب الكهربائي في أنبوب يحتوي على BM. قم بتوصيل القطب الكهربائي بمقياس TEER اليدوي وقم بتشغيل مفتاح الوظيفة للقياس بأوم وتشغيل مفتاح الطاقة. ضع القطب القصير في المقصورة القمية للإدراج والقطب الطويل في المقصورة القاعدية الجانبية دون لمس الطبقة الأحادية. قم بقياس المقاومة في البئر الفارغ ، ثم في العينات المتبقية.
اغسل القطب الكهربائي باستخدام BM بين العينات ذات الظروف المختلفة. عند الانتهاء ، قم بتنظيف القطب الكهربائي بماء ديمي وب 70٪ إيثانول ، ثم اتركه يجف في الهواء. تم استخدام هذا البروتوكول لحصاد المواد العضوية المعوية وإعداد طبقات أحادية من الخلايا الظهارية.
تظهر هنا طبقة أحادية تم استزراعها لمدة ثمانية أيام في IEM. يمكن ملاحظة بنية عند تعريض الطبقات الأحادية لوسط تمايز الخلايا المعوية أو EDM ، في حين أن الطبقات الأحادية المعرضة لوسط مركب أو CDM تظهر بنية أكثر سلاسة. أعقب تكوين الطبقة الأحادية كميا قياس TEER.
كان للطبقة الأحادية المتقاربة تماما قيمة TEER تبلغ حوالي 100 أوم سنتيمتر مربع والتي تزداد عند تعرضها لأي من وسيط التمايز. أظهرت الطبقات الأحادية في جميع الظروف المتوسطة نفاذية واضحة أقل لأصفر لوسيفر. كان إفراز الليزوزيم بواسطة الطبقات الأحادية اللفائفية المستزرعة في IEM أعلى من إفراز الطبقات الأحادية المستزرعة في IEM حتى التقت ولمدة أربعة أيام أخرى في EDM أو CDM.
تظهر الطبقات الأحادية المستزرعة في IEM و IEM و EDM اللاحقة أو IEM و CDM اللاحقة اختلافات في المورفولوجيا التي لوحظت مع بقع H & E و Ki67 و MUC2 و Alcian Blue. عند التمايز ، انخفضت الخلايا التكاثرية ، في حين زاد التعبير الجيني للخلايا الكأسية والخلايا المعوية مقارنة بتلك التي لوحظت في ظل ظروف IEM كما هو موضح في LGR5 و MUC2 والتعبير الجيني القلوي للفوسفاتاز. عند تحضير الطبقات الأحادية ، من المهم منع anoikis في المواد العضوية بعد هضمها.
بالإضافة إلى ذلك ، يجب توزيع ECM في الخلايا بالتساوي على أغشية Transwell. تسمح الطبقات الأحادية المشتقة من المواد العضوية بتقييم عمليات نقل الجزيئات باستخدام ركائز فلورية مختلفة بطريقة خاصة بالمريض.
