نموذج خارج الجسم الحي هو طريقة مفيدة لتقييم تأثير التدخلات الفسيولوجية المختلفة والمركبات الدوائية وامتصاص الجلوكوز في العضلات. تسمح هذه التقنية بإجراء تقييم دقيق لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية للفأر المعزول في حالة عدم وجود عوامل مربكة قد تتداخل في نموذج حيواني سليم. قبل البدء في التجربة ، قم بتشغيل نظام السيرة الذاتية المتكامل لشريط العضلات وقم بتسخين الغرف إلى 30 درجة مئوية.
افتح برنامج جمع البيانات وقم بمعايرة محولات الطاقة القسرية لضمان إمكانية المقارنة بين مجموعات البيانات. أضف أربعة ملليلترات من وسط الحضانة القاعدية 30 درجة مئوية الذي تم تسخينه مسبقا إلى كل غرفة حضانة وتأكد من أن الوسط مؤكسج باستمرار بنسبة 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ضع الماوس في وضع الانبطاح على صينية تشريح وتأكد من عدم الاستجابة لرد فعل الدواسة.
ثم قم بتثبيت مخلب أمامي واحد بإبرة. استخدم المقص لإزالة الجلد من أسفل الساق حتى يصبح كل من وتر العرقوب ومفصل الركبة مرئيين. لتشريح العضلة الوحيدة، قم بتوصيل حلقة خياطة واحدة قطرها 0.4 سم محضرة من قطعة خياطة نايلون جراحية غير قابلة للامتصاص بطول 16 سم إلى وتر العرقوب وقم بتأمين ملقط العرقوب على وتر العرقوب بشكل بعيد إلى الحلقة.
قطع لتحرير العضلات النعل و gastrocnemius من مخلب وتحريك ملقط peen بعناية عبر الماوس لفضح العضلات الوحيدة. ثبت ملقط البينات وضع حلقة خياطة ثانية حول الوتر القريب للعضلة الوحيدة. قطع الوتر القريب وتشريح النعل بما في ذلك حلقتي خياطة المرفقتين خالية من عضلة المعدة والأوعية الدموية.
عند الجمع ، استخدم الحلقات لربط عضلة النعل بسرعة بالخطافات المعنية في إحدى غرف الحضانة. استخدم الملقط لإزالة اللفافة التي تغطي العضلة الأمامية للظنبوب. يجب أن تكون الأوتار البعيدة للعضلات الأمامية أو EDL بيضاء صافية ومرئية ومنفصلة عن بعضها البعض.
قطع وتر تقطير العضلة الأمامية الظنبوب وتشريح العضلات. استخدم الملقط لتحرير عضلة EDL بلطف من الأنسجة المحيطة بها ، مع ترك العضلات سليمة دون قطع الأوتار. ضع حلقات خياطة فردية حول أوتار التقطير وأوتار EDL القريبة.
عندما يتم وضع الحلقات ، قم بقطع الأوتار لتحرير عضلة EDL مع حلقات الخياطة المرفقة وقم بتوصيل الحلقات بسرعة بالخطافات في غرفة الحضانة الثانية. ثم اضبط توتر الراحة لكل عضلة على ما يقرب من خمسة مللي نيوتن واسمح للعضلات بالتوازن في الوسط لمدة 10 دقائق على الأقل قبل بدء التجربة. لقياس امتصاص الجلوكوز المحفز للأنسولين ، استبدل وسط الحضانة القاعدي في الغرف بوسط الحضانة بدون الأنسولين ، أو تركيز الأنسولين الفعال دون الحد الأقصى ، أو تركيز الأنسولين الفعال إلى أقصى حد لمدة 20 دقيقة.
في نهاية فترة التحفيز ، استبدل وسط الحضانة بوسط حضانة امتصاص الجلوكوز الذي يحتوي على تركيز مماثل من الأنسولين لمدة 10 دقائق. في نهاية حضانة امتصاص الجلوكوز ، قم بإزالة العضلات بعناية من غرف الحضانة واغسل العينات في وسط حضانة القاعدية الباردة الثلجية. بعد الغسيل ، جفف العضلات بسرعة على ورق الترشيح وقم بتجميد الأنسجة دون حلقات خياطة في النيتروجين السائل.
ثم جمع 100 ميكرولتر من وسط حضانة امتصاص الجلوكوز من كل غرفة لتخزين 20 درجة مئوية وتحليل امتصاص الجلوكوز في العضلات. لقياس امتصاص الجلوكوز المحفز للانقباض ، ضع أقطاب البلاتين مركزيا وعلى جانبي العضلات داخل غرف الحضانة ، وابدأ تقلص العضلات مباشرة بعد استبدال وسط الحضانة القاعدية بوسط حضانة امتصاص الجلوكوز. سجل الإنتاج القسري من كل عضلة محتضنة.
بعد 10 دقائق ، قم بجمع العضلات وتجميدها بلطف كما هو موضح ، وتخزين 100 ميكرولتر من وسيط حضانة امتصاص الجلوكوز من كل غرفة لتحليل امتصاص الجلوكوز في العضلات كما هو موضح. لتحديد إشارات الخلايا العضلية عن طريق تحليل النشاف الغربي في نفس المجموعة من عينات العضلات ، قم بتجانس كل عينة عضلية مجمدة في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتجانس البارد على الجليد وقم بتدوير نهاية العينة على نهايتها لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. ثم جمع الليسات عن طريق الطرد المركزي وقياس كمية البروتين ذات الأهمية داخل كل عينة البليت وفقا لبروتوكولات تحليل اللطخة الغربية القياسية.
لقياس امتصاص الجلوكوز في كل عينة، أضف 150 ميكرولتر من الفائق من كل عينة و 25 ميكرولتر من وسط حضانة امتصاص الجلوكوز من غرف الحضانة المقابلة لفصل قوارير عد التلألؤ السائل التي تحتوي على ثلاثة ملليلترات من سائل التلألؤ السائل لكل قارورة. ثم قم بتحميل القوارير على عداد تلألؤ سائل وقياس النشاط الإشعاعي لاثنين من ديوكسي جلوكوز ومانيتول وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. في هذا التحليل التمثيلي ، كانت معدلات امتصاص الجلوكوز القاعدي متشابهة بين عضلات النعل و EDL المعزولة من الفئران الإناث.
زاد امتصاص الجلوكوز في عضلات النعل و EDL استجابة لتركيزات الأنسولين الفعالة إلى أقصى حد وأقصى حد. علاوة على ذلك ، كان كل من الأنسولين دون الحد الأقصى والحد الأقصى لامتصاص الجلوكوز المحفز أعلى بكثير في العضلات الوحيدة. في المقابل، كان امتصاص الجلوكوز الناجم عن الانكماش أعلى بكثير في EDL مقارنة بالعضلات الوحيدة.
هنا ، يمكن ملاحظة القوة العضلية القصوى المنتجة في عضلات النعل و EDL خلال فترة التحفيز التي تبلغ 10 دقائق. وكما هو متوقع، ولدت عضلة EDL المزيد من القوة خلال الجزء الأول من فترة التحفيز، تليها انخفاض سريع في وقت لاحق من فترة التحفيز. أدت تركيزات الأنسولين دون القصوى والقصوى إلى زيادة في فسفرة Akt threonine 308 و TBC1D4 Serine 588 ، في حين أدى الانكماش إلى زيادة في فسفرة AMPK Alpha threonine 172 و ACC serine 212.
لم يؤد الأنسولين ولا الانكماش إلى تغيير في محتوى البروتين الكلي. قبل محاولة قياس امتصاص الجلوكوز في عضلات الفئران المعزولة ، من الضروري ممارسة تشريح عضلات النعل و EDL بدقة. بعد تقييم امتصاص الجلوكوز في العضلات ، يمكن استخدام تحلل بروتين العضلات المتبقي لإجراء تحليل كيميائي حيوي إضافي قد يوضح التغيرات الملحوظة في معدلات امتصاص الجلوكوز.
