امتصاص الجلوكوز هو المفتاح لفهم الصحة والمرض. كما يلعب الجلوكوز دورا محوريا في المتطلبات الأيضية والهيكلية في جسم الإنسان ، فضلا عن لعب دور حيوي في التنظيم. يسمح القياس خارج الخلية للجلوكوز بتطوير مقايسات عالية الإنتاجية لحركية امتصاص الجلوكوز في الخلايا والأنسجة والأعضاء ذات الخلفية الوراثية المختلفة استجابة للمغذيات أو الأدوية.
سيكون هذا الفحص أداة قيمة لاكتشاف العلاجات والتغذية لمرض السكري والسرطان والأمراض التنكسية في الجهاز العصبي المركزي والسمنة وجميع أمراض الجلوكوز والتمثيل الغذائي. يحتاج الفحص إلى تعديل الوقت للمجاعة والتحفيز الذي يجب أن يستند إلى تفاصيل التمثيل الغذائي للأنسجة ومزارع الخلايا المختلفة. زراعة الخلايا الليفية للفأر 3T3-L1 عن طريق طلاء 10 إلى 6 خلايا ، مخففة في 20 ملليلتر من المتوسط 1 في 296 لوحة بئر.
لوحة 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا لكل بئر ، مما يضمن الحفاظ على تجانس هذا التعليق عن طريق الخلط. تنمو الخلايا لمدة 48 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية دون تغيير الوسائط حتى حوالي 70 إلى 80٪ التقاء. الحفاظ على الخلايا ملتقية وصائمة عن طريق زراعتها في نفس الوسط لمدة 48 ساعة.
تختلف مدة الحضانة من 24 إلى 72 ساعة ، اعتمادا على حالة هدم الصيام المطلوبة. صب الوسائط من الخلايا في لوحات البئر 96. امتص السائل المتبقي باستخدام مناشف ورقية معقمة.
شطف طبق البئر 96 مع 100 ميكرولتر من PBS لكل بئر ، وامتصاص السائل المتبقي بمناشف ورقية معقمة. أضف 100 ميكرولتر من DMEM الخالي من الجلوكوز لكل بئر ، واحتضنه لمدة 40 دقيقة. اضبط وقت الحضانة اعتمادا على محفزات نوع الخلية ، والمستوى المطلوب من الصيام.
استخدم ثمانية نسخ متماثلة لكل حالة محاكاة. لذلك ، قم بإعداد ملليلتر واحد لكل حالة محاكاة. استخدم سبع حالات محاكاة بدون أنسولين.
FD الجلوكوز من 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر ، 1 ميكروغرام لكل ملليلتر ، 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر ، 0.2 ميكروغرام لكل ملليلتر ، 0.1 ميكروغرام لكل ملليلتر ، 0.05 ميكروغرام لكل ملليلتر ، و 0 ملليغرام لكل ملليلتر في 196 لوحة بئر. استخدم سبعة شروط تحفيز مع الأنسولين. FD الجلوكوز من 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر ، 1 ميكروغرام لكل ملليلتر ، 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر ، 0.2 ميكروغرام لكل ملليلتر ، 0.1 ميكروغرام لكل ملليلتر ، 0.05 ميكروغرام لكل ملليلتر ، و 0 ميكروغرام لكل ملليلتر في لوحة بئر 96 أخرى.
لإعداد ظروف التحفيز ، قم بتخفيف ميكرولتر واحد من خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من محلول عمل الجلوكوز FD ، و 999 ميكرولتر من DMEM الخالي من الجلوكوز للحصول على ملليلتر واحد من محلول مخزون العمل. باستخدام حل المخزون العامل هذا ، قم بإعداد 1 إلى 2000 ، 1 إلى 5،000 ، 1 إلى 10،000 ، 1 إلى 25،000 ، 1 إلى 50،000 ، و 1 إلى 100،000 أوهام الجلوكوز FD للحصول على 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر ، 1 ميكروغرام لكل ملليلتر ، 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر ، 0.2 ميكروغرام لكل ملليلتر ، 0.1 ميكروغرام لكل ملليلتر ، 0.05 ميكروغرام لكل ملليلتر في أنبوبين ملليلتر مباشرة قبل التجارب في خزانة السلامة البيولوجية بدون أضواء. أضف ميكرولتر واحد من الأنسولين إلى كل من هذه الحالات.
بعد 40 دقيقة من الحضانة ، قم بصب DMEM الخالي من الجلوكوز من كل بئر في 96 لوحة بئر ، وامتص السائل المتبقي بمناشف ورقية معقمة. أضف 100 ميكرولتر لكل منها من ظروف العلاج المختلفة الموصوفة من قبل ، إلى الآبار على طول عمود واحد. و 100 ميكرولتر من نفس حالة العلاج إلى الآبار على طول الصف في كل من لوحات الحائط 96.
قم بتسمية الألواح التي استخدمت الظروف ، مع وبدون الأنسولين. أضف DMEM الخالي من الجلوكوز وحده إلى آبار التحكم. احتضن اللوحة لمدة 40 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا في الظلام.
بعد تحفيز الخلايا لمدة 40 دقيقة. انقل وسائط التحفيز من كلا اللوحتين إلى 96 لوحة بئر جديدة ، مع الحفاظ على نفس التصميم التجريبي. اغسل الخلايا باستخدام PBS.
قم بإزالة PBS وصب أي محلول متبقي على مناشف ورقية معقمة. أضف مثبط الأنزيم البروتيني إلى المخزن المؤقت لفحص الترسيب المناعي الراديوي لحماية البروتينات. ضع لوحات تحتوي على فحص الترسيب المناعي الراديوي في شاكر لمدة 30 دقيقة.
باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة ، قم بقياس التألق عند الإثارة والأطوال الموجية للانبعاثات عند 485 و 535 نانومتر على التوالي. أولا في الوسط الذي يحتوي على الجلوكوز FD خارج الخلية ، ثم اللوحة مع فحص الترسيب المناعي الإشعاعي الخلايا lized في نهاية 30 دقيقة من الحضانة. قم بإجراء فحص بروتين BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
تحديد تركيزات البروتين في كل بئر يحتوي على خلايا مقايسة الترسيب المناعي الراديوي. استخدم 10 ميكرولترات من مقايسة التجانس المناعي الراديوي ، وقم بقياس تركيزات البروتين ، وثلاثة أضعاف لزيادة دقة القياسات في 96 لوحة بئر. حدد كمية البروتين بناء على معايير البروتين التي تم تحليلها مع عينات على كل طبق بئر 96.
احتضان الأنسجة أو الأعضاء التي تم حصادها في صفيحة بئر ستة تحتوي على PBS لمدة دقيقة واحدة. تعامل مع كل نسيج أو عضو في بئر منفصل. بعد دقيقة واحدة ، ضع كل منديل على منشفة ورقية معقمة لامتصاص PBS.
انقل الأنسجة أو الأعضاء في صفيحة حائط منفصلة من ستة جدران تحتوي على 4000 ميكرولتر من DMEM الخالي من الجلوكوز ، واحتضنها لمدة دقيقتين. بعد دقيقتين ، قم بإزالة الأنسجة ونقلها إلى آبار من صفيحة من ستة آبار تحتوي على محلول عمل الجلوكوز FD 0.29 Millimolar FD. احتضان لوحات الآبار الستة التي تحتوي على أنسجة في محلول عمل الجلوكوز FD عند 37 درجة مئوية.
جمع 100 ميكرولتر من محلول عمل الجلوكوز FD من كل بئر بعد 0 و 10 و 20 و 30 و 40 و 60 و 90 و 120 دقيقة من الحضانة ، ونقل 100 ميكرولتر من محلول عمل الجلوكوز FD إلى 96 لوحة بئر لتحليل حركية استنفاد الجلوكوز FD خارج الخلية. رجه قبل وبعد التجميع. قم بقياس التألق عند الإثارة في الأطوال الموجية للانبعاثات عند 485 و 535 نانومتر على التوالي باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة.
تم زيادة الاعتماد على الجرعة في امتصاص الجلوكوز داخل الخلايا من FD بشكل كبير في وجود الأنسولين. أدى تحفيز الأنسولين إلى انخفاض كبير في مستويات الجلوكوز في FD خارج الخلية مقارنة بالعينات التي لا تحتوي على تحفيز الأنسولين. يمكن أن يقيس استنفاد الجلوكوز خارج الخلية من الجلوكوز FD تغيرا في امتصاص الجلوكوز بدقة مماثلة لامتصاص الجلوكوز FD داخل الخلايا.
لم يتم استنفاد الجلوكوز FD خارج الخلية في الدهون الحشوية غير المحفزة خلال 120 دقيقة من الحضانة. في المقابل ، أدت المعالجة المسبقة للفئران بالأنسولين أو AAC2 قبل التشريح ، إلى استنفاد كبير لجلوكوز FD خارج الخلية في غضون فترة زمنية مدتها 30 دقيقة و 60 دقيقة على التوالي. لم يتم استنفاد الجلوكوز FD خارج الخلية في عمليات إزالة الكبد المحفزة بالأنسولين ، مقارنة ب explants الكبد غير المحفزة.
انخفض الجلوكوز FD خارج الخلية بشكل كبير بالطريقة المعتمدة على الوقت ، ولوحظ أن الكبد يزرع معالجا مسبقا باستخدام AAC2.22٪ من استنفاد الجلوكوز في الوسط خارج الخلية الذي يحتوي على الدماغ غير المعالج بعد 60 دقيقة من الحضانة. أظهر الوسط المحتضن مع أدمغة من الفئران المعالجة بالأنسولين انخفاضا خطيا بنسبة 5٪ في الجلوكوز FD. أدى تحفيز الأدمغة AAC2 إلى انخفاض سريع عميق إلى 67.4٪ من الجلوكوز FD خارج الخلية خلال الدقائق العشرين الأولى.
المادة التي تنطوي على الغسيل مهمة بشكل خاص لإزالة آثار الجلوكوز أو الدم أو المصل داخل الوسط أو الأعضاء ، لأنها يمكن أن تتداخل مع القراءة الفلورية لهذه الوسائط. بعد تحديد الإنتاجية العالية لمركبات المستقلبات في الجينات ذات الخصائص الجلايسيمية ، وكذلك الظروف المثلى لعملها في تجارب الجسم الحي ، يمكن التحقق من صحتها باستخدام الجلوكوز FD المسمى ومسح PET لتأكيد تراكم الجلوكوز في أعضاء محددة. هذه التقنية لاكتشاف عمل نسبة السكر في الدم مفيدة على حد سواء في حذف العديد من الأيضات والعلاجات أو مجموعاتها ، وتسلط الضوء على أفعالها في أعضاء مختلفة.
