وهذا البروتوكول هام لأنه يصف طريقة يمكن استخدامها لفصل عدة إشارات فلورية في عينة واحدة. وبالمقارنة مع الأساليب التقليدية، يمكن أن يزيد المسح الضوئي من سرعة التجربة ويحسن حساسية البيانات. باستخدام مصادر الإضاءة المختلفة مثل ليزر supercontinuum ، قد تكون هذه الطريقة قابلة للتطبيق على القرص الغزل أو الليزر المسح المجهر المجهر.
عند إجراء المسح الضوئي، التصوير الطيفي المجهري، من المهم التحقق من أن ذروة الإثارة لكل ملصق فلوري يحدث في طول موجي مختلف. للبدء، قم بإعداد مجهر مقلوب للفلورانس وكاميرا كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم تحميل العينة على خشبة المسرح.
من القائمة المنسدلة في النافذة الرئيسية micromanager، حدد 475 نانومتر لعرض العينة الأولية. ثم انقر نقراً مزدوجاً فوق المربع الموجود بجوار التعرض، وأدخل 100 لضبط وقت التعرض على 100 مللي ثانية. وأخيراً، انقر مباشرة لعرض العينة.
الآن انقر على السيارات. زر نطاق عرض الكثافة التلقائية لتحقيق الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم في نطاقات مرئية ذات معنى. بعد ذلك ، استخدم مقابض التركيز في المجهر لتركيز العينة.
بمجرد التركيز، ضبط موضع العينة بحيث تكون الحافة في وسط مجال الرؤية. ثم صقل التركيز. تكون العينة في بؤرة التركيز عندما تظهر ميزات الحافة في الصورة حادة.
الآن، افتح أداة الاستحواذ متعددة الأبعاد. في القائمة، انقر فوق زر التحميل واختر إعدادًا مسبقًا يحتوي على نطاق الطول الموجي المناسب للحصول على الاكتساب الطيفي. بمجرد تأكيد إعدادات الامتلاك، انتقل إلى منطقة فارغة من العينة وانقر فوق الحصول على تجميع مجموعة صور طيفية تحتوي على خلفية وضوضاء لاستخدامها للطرح في وقت لاحق.
ثم، انتقل حول العينة للعثور على ألمع المناطق. ومن المرجح أن يكون للعينات فلورانس أكثر كثافة بعيدا عن حافة العينة. بمجرد أن تقع المنطقة الأكثر سطوعًا، خذ رصة صورة واحدة.
قم بتحميل الصورة المكتسبة في صورة J واستخدم وظيفة قياس Image J للتأكد من عدم وجود أطوال موجية تحتوي على بيكسلات مكشوفة. إذا كان من الضروري تقليل وقت التعرض بسبب التعرض المفرط ، يجب استعادة صورة الخلفية مع وقت التعرض الجديد أيضًا. إذا وجد أن أي من الصور تحتوي على الحد الأعلى للكشف عن الكاميرا، ضبط وقت التعرض للمسح الطيفي لضمان أن الإشارة القصوى في جميع أنحاء النطاق الطيفي لا يتجاوز النطاق الديناميكي للكاميرا.
مع وقت التعرض المناسب الآن تحديد، وضع عينة unlabeled على خشبة المسرح. الحصول على بيانات الصورة الطيفية من العينة غير التي تم تصنيفها لتحديد ما إذا كان هناك أي فلورة تلقائية. ثم ضع عينة واحدة على المسرح.
الحصول على بيانات الصور الطيفية من كل عينة من العينات ذات التسمية الواحدة لاستخدامها كضوابط طيفية لبناء مكتبة طيفية. إجراء المسح الضوئي لكل عينة تحكم باستخدام وقت التعرض للنطاق الموجي متطابقة وإعدادات الكاميرا. بعد ذلك، ضع شريحة تحتوي على العينة التجريبية على المجهر.
حدد حقل عرض تم تصنيفه بشكل مناسب للخلايا والحصول على بيانات الصورة الطيفية من العينة باستخدام إعدادات الاكتساب المحددة. صور تصحيح إلى استجابة طيفية مسطحة عن طريق طرح الطيف الخلفية من صورة العينة وضرب الصورة في معامل التصحيح. هنا ، يتم استخدام برنامج MATLAB لمعالجة الصور بسرعة.
بعد ذلك، قم بإنشاء المكتبة الطيفية. للحصول على أفضل النتائج، تطبيع كل عضو نهاية إلى الفرقة الطول الموجي من أكبر كثافة عن طريق تحديد أي الفرقة الطول الموجي له قيمة أكثر كثافة وتقسيم القياس في كل نطاق الطول الموجي من قبل تلك القيمة القصوى. ثم احفظ البيانات الطيفية كملف دات.
عند اكتمال، unmix بيانات الصورة الطيفية. سوف تؤدي الخطوة غير المُزكّاة إلى توليد صورة وفرة لكل ملصق فلوري، حيث تكون الوفرة هي مقدار الإشارة الفلورية النسبية في الصورة من الملصق المحتمل. بعد ذلك، افتح كل صورة غير مُزوّت لمعاينة توزيع المكونات النقية بصريًا.
مقارنة حجم صورة الخطأ مع تلك الصور غير المُزكّت. إذا كان حجم صورة الخطأ مشابه لصور الوفرة غير المُزكّت، فقد لا يتم حساب الإشارات في بيانات الصورة الطيفية بدقة. وأخيراً، تحقق من وجود هياكل متبقية غير محددة عن طريق مقارنة صورة الخطأ إلى الصور غير المُزكّت.
عندما يتم تنفيذها بشكل صحيح، تسمح عملية فك الدمج الطيفي بفصل كومة صورة طيفية إلى مساهمات كل منها من كل تسمية مضنية. هنا، صورة طيفية غير مُجَزَزة مع صور فردية تسلط الضوء على مجرى الهواء السلس لخلايا العضلات، ومسبار GCaMP وتسمية الميتوكوندريا. وهناك خطأ كبير مرتبط بالمنطقتين النووية والقعقعية من الخلايا مما يشير إلى أن الأطياف المقاسة لتلك المناطق لا تُحسَّن جيداً بالأطياف الموجودة في المكتبة الطيفية.
الأطياف النقية التي تم جمعها من الخلايا المسماة التي هي أيضا autofluorescent من المرجح أن تلوث التشكيل الجانبي الطيفي للمكون النقي. هنا، يمكن للمرء أن يرى الفرق من الاحتياك مع الأطياف النقية الملوثة مع الفلورا، مقابل الأطياف النقية تصحيح بعد الطرح تحجيم. إن الحصول على البيانات المناسبة أمر ضروري عند تصوير العينات الحساسة لأنها قد تبقى على قيد الحياة فقط في جلسة تصوير واحدة على عكس الخلفية والضوابط التي قد تكون reimaged.
تأكد من أن الأجهزة المناسبة وإعدادات الامتلاك محددة مسبقاً قدر الإمكان. وكخطوة تالية، يمكن استخدام مقاطع الفيديو التي تم إنشاؤها من بيانات الفاصل الزمني التي تم الحصول عليها باستخدام هذا النظام لتتبع المصادر الفلورية في مواقع سرية مع مرور الوقت مثل تعريب إشارة المرسل الثاني. الحرص عند استخدام مصادر الضوء قوية لتجنب التعرض للعين.
أيضا، تأكد من ارتداء القفازات المناسبة عند التعامل مع الملصقات البيولوجية.
