وغالبا ما تسترشد الهجرة الجماعية الخلية من قبل التدرج من جزيئات الإشارة. في هذا الفيديو، نُظهر كيفية قياس القوى الخلوية خلال الهجرة الجماعية مسترشدة بالتدرج الكيميائي الحيوي. لذلك، نحن دمج رقاقة microfluidic مع مجهر الجر، ثم نستخدم رقاقة microfluidic لتوليد التدرج البيوكيميائي، ونستخدم المجهر الجر لقياس القوة الخلوية.
الدكتور هوانسيوك جانغ، بعد غراد في مختبري، سوف تظهر الإجراء. إعداد حل PDMS عن طريق خلط عامل مِعَد القاعدة و العامل العلاجي بنسبة عشرة إلى واحد. ضع 15 ملليلتر من مليسومر القاعدة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر ، وأضف 1.5 ملليلتر من عامل المعالجة.
إعداد اثنين من هذه الأنابيب. دوامة خليط PDMS لمدة خمس دقائق قبل الطرد المركزي في 196 ز الوقت لمدة دقيقة واحدة لإزالة فقاعات. لتصنيع استنسل PDMS، صب ما يقرب من ملليلتر من خليط PDMS على رقاقة مع تجنب المناطق SU-8 منقوشة بحيث تلامس PDMS جانب أعمدة SU-8 ولكن ليس الجزء العلوي من نمط SU-8.
ضع الرقاقة على سطح مستو لأكثر من 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم عالج جهاز PDMS في فرن جاف عند 80 درجة مئوية لأكثر من ساعتين. قشر بعناية قبالة PDMS من قالب SU-8، وتقليم غشاء PDMS رقيقة باستخدام لكمة جوفاء 14 ملليمتر. قم بإزالة الغبار على سطح قطع PDMS باستخدام الشريط اللاصق قبل التكlaving في استنسل PDMS.
لتصنيع قناة مجهرية PDMS ، صب ما يقرب من 30 ملليلتر من خليط PDMS على قالب SU-8. ديغا لمدة 30 دقيقة في غرفة فراغ، ومن ثم علاج PDMS في فرن جاف في 80 درجة مئوية لأكثر من ساعتين. قشر بعناية قبالة PDMS من قالب SU-8، وقطع PDMS إلى حجم 24 ملليمترا من 24 ملليمتر.
في كل كتلة PDMS، إنشاء منفذ واحد وثلاثة مداخل باستخدام لكمة خزعة ملليمتر واحد. تصنيع وsilanize الشرائح الزجاجية كما هو موضح في بروتوكول النص. تغطية السطح ذو الحواف من الزجاج السفلي مع 100 ميكرولترات من حل ربط سيلاني.
بعد ترك الزجاج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، شطف الزجاج ثلاث مرات بالماء غير المؤين. ثم اسمحوا الزجاج الجاف في درجة حرارة الهواء المحيط أو عن طريق تهب الهواء المضغوط. إعداد حل هلام polyacrylamide كما هو موضح في بروتوكول النص.
ثم نقل ل10 ميكرولترات من حل هلام مختلطة على microwell مستطيلة ووضع زلة غطاء دائري على القمة. إصلاح الجمعية من الزجاج المخصص، حل هلام، وزلة غطاء على غلاف لوحة ستة جيدا مع شريط لزجة والوجه عليه. ثم الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 96 مرات ز لجلب جزيئات الفلورسنت إلى الطبقة العليا من هلام بوليكريلاميد.
إزالة التجميع من جهاز الطرد المركزي ووضعها على سطح مستو مع زلة الغطاء متجهة إلى أسفل. بعد 30 دقيقة، الوجه التجمع ووضعها في طبق بيتري 35 ملليمتر. ملء الطبق مع مليلتر اثنين من المياه الأيونية.
باستخدام ملقط، قم بإزالة زلة الغطاء بلطف عن طريق تحريكها إلى جانب واحد. لرمز الكولاجين على هلام البولي أكريلاميد، حل مليغرام واحد لكل ملليلتر sulfo-SANPAH في عازلة HEPES 50 ملليمترا الحارة. إسقاط 200 ميكرولترات من الحل على سطح هلام وتنشيطها عن طريق ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة.
بعد تنشيط الأشعة فوق البنفسجية، شطف هلام مرتين مع 0.1 مولا HEPES العازلة، ومن ثم مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. رمز هلام البولي أكريلاميد مع محلول الكولاجين في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، غسل الجل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
انغمس في استنسل PDMS المُتَوَغَل في حل F-127. احتفظ بها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. اغسل استنسل PDMS مع PBS ثلاث مرات ، وازيل السائل من كل من استنسل PDMS وجل polyacrylamide.
ثم ضع استنسل PDMS على هلام البولي أكريلاميد، وأضف برنامج تلفزيوني إلى الاستنسل. إزالة فقاعات في ثقوب الاستنسل PDMS عن طريق الأنابيب بلطف. بعد إزالة الفقاعات، مسح برنامج تلفزيوني من سطح استنسل PDMS.
الآن إضافة 200 ميكرولترات من حل الخلية على استنسل PDMS ووضع الجل في حاضنة لمدة ساعة واحدة بحيث تعلق الخلايا على هلام polyacrylamide. بعد الحضانة، وغسل بلطف قبالة حل الخلية مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية وإضافة المزيد من وسائل الإعلام ثقافة الخلية. إزالة الاستنسل PDMS، والتحقق من تشكيل الجزر الخلية تحت المجهر.
بعد ذلك، علاج سطح القناة الدقيقة PDMS مع بلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية. بعد إزالة أي سائل على الزجاج السفلي المليء بالجل، ضع القناة الدقيقة PDMS فوق الزجاج السفلي، ووضع الجمعية على حامل الزجاج المخصص. تعبئة القناة الصغيرة مع خلية ثقافة المتوسطة.
لتحضير أنابيب مدخل نظام microfluidic المتكاملة، قم بتوصيل إبرة مشذبة وخط حجم صغير 30 سنتيمتر مع stopcock ثلاثية الاتجاه. إعداد ثلاثة من هذه الترتيبات. بالنسبة لموابيب المنفذ، قم بتوصيل إبرة مشذبة وخط حجم صغير طوله 75 سنتيمترًا مع stopcock ثلاثي الاتجاه.
تعبئة خطوط الأنابيب مع الوسيطة التي تم تسخينها مسبقاً لمدة ساعة واحدة. إعداد الخزانات عن طريق إزالة المكبس من المحاقن وربط خطوط أنابيب المدخل. قم بتوصيل موصلات الإبر لكل خط أنابيب في المداخل الثلاثة ومأخذ واحد من الجهاز microfluidic.
املأ كل خزان بثلاثة ملليلترات من المتوسط الطازج أو المتوسط المُشروط. بالنسبة لاختبار التدرج، املأ خزان المدخل الأيسر بـ 20 نانوغرام لكل ملليلتر معامل نمو كبدي، أو HGF، في وسط ثقافة الخلية. للتصور من التدرج التركيز، إضافة 200 ميكروغرام لكل ملليلتر من صبغة الفلورسنت إلى خزان مدخل اليسار.
قم بتوصيل خط أنابيب المنفذ بمضخة حقنة. ضع نظام microfluidic المتكامل على خشبة المسرح من المجهر الظهارة التقليدية. التقط الصور كل 10 دقائق لمدة تصل إلى 24 ساعة باستخدام مجهر آلي في حاضنة.
في كل نقطة زمنية، خذ مجموعة من الصور باستخدام عدسة هدف 4X في ثلاث قنوات مختلفة، بما في ذلك صورة المرحلة لتصور هجرة الخلايا، وصورة فلورية خضراء لتصور الخرز الفلورسنت المدمج في الجل، وصورة فلورية حمراء لتصور تدرج تركيز المادة الكيميائية. بعد أخذ الصور الفاصل الزمني، ضخ 0.25٪ تريبسين-EDTA حل في القنوات الدقيقة لفصل الخلايا من هلام بوليكريلاميد. عند إزالة الخلايا من الجل تمامًا ، خذ صورة فلورسنت خضراء لاستخدامها كصورة مرجعية للمجهر الجر.
تابع تحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. لقياس قوة الانقبال والإجهاد بين الخلايا، تم الجمع بين المجهر الجر والمجهر الإجهاد أحادي الطبقات مع قناة microfluidic. وقد رسمت الخرائط في تنسيق الراديو مع الجر الخارجي باستخدام اللون الدافئ والجر إلى الداخل باستخدام اللون البارد.
في الوقت صفر، وأظهرت جميع الجزر توزيعات الجر مماثلة مع الجر الداخلي قوية على الحافة وتقلبات داخل الجزيرة. بعد 10 ساعات من تطبيق التدرج HGF، في حين كانت درجة توسع الجزيرة مختلفة في كل عمود، كانت توزيعات الجر مشابهة إلى حد كبير إلى الصفر الوقت. ولم يتغير متوسط الجر لمدة 10 ساعات.
عند حساب الإجهاد أحادية الطبقة، ومع ذلك، أظهر كل عمود اتجاهات مختلفة. حيث كان تركيز HGF منخفضًا ، تم الحفاظ على متوسط التوتر داخل الجزر حوالي 200 باسكال خلال فترة 10 ساعات. حيث كان تركيز HGF مرتفعًا ، انخفض متوسط التوتر داخل الجزر تدريجيًا من 230 باسكال إلى 100 باسكال على مدار 10 ساعات ، كما هو موضح سابقًا.
حيث كان تركيز HGF مرتفعًا على النصف الأيسر ومنخفضًا في النصف الأيمن من الجزيرة ، تم الحفاظ على متوسط التوتر حول 150 باسكال. ملء قناة microfluidic يجب أن يكون لطيف. من المهم إزالة فقاعات المحاصرين في القناة في حين لا تعطيل في وقت واحد الجزر الخلية الأم الصغيرة.
باستخدام هذا النظام المتكامل، يمكن للمرء أن التحقيق في كيفية استجابة جماعية الخلية ميكانيكيا لمختلف التدرجات الكيميائية، مثل جذب المواد الكيميائية أو عوامل النمو. وستساعدنا هذه المنصة على مواصلة استكشاف آليات هجرة الخلايا الجماعية تحت التدرجات الكيميائية، والتي هي المفتاح لفهم التجديد، وانبثاث السرطان، والتنمية.
