يحدد هذا البروتوكول إنتاج خلايا الريسوس المناعية التي تعبر عن بروتينين: مستقبل مستضد اتمريك مضاد للفيروسات ومستقبلات chemokine CXCR5 التي تستهدف الخلايا إلى بصيلات اللمفاوية. هذا الإجراء السريع نسبيا لمدة تسعة أيام تنتج الخلايا التائية مع أقل تميزا نمط الظاهري الذاكرة المركزية مع احتمال طويل الأجل الثابتة بعد ضخ في الحيوانات. وسيتيح تكييف هذه الطريقة مع الخلايا البشرية إنتاج الخلايا التائية المناعية التي يمكن أن تحفز على مغفرة دائمة لفيروس نقص المناعة البشرية دون تناول العقاقير المضادة للفيروسات العكوسة.
ويمكن استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع لإنتاج خلايا الريسوس تي التعبير عن البروتينات الأخرى من الفائدة. ومع تعديلات طفيفة، يمكن استخدامه لتوليد الخلايا التائية المُحولة في أنواع أخرى بما في ذلك البشر. ويعتمد نجاح عملية النقل على مراكز الـ PBMCs الصحية المحفزة.
يجب توخي الحذر في الجمع والنقل والتخزين. قبل عملية النقل، من المهم تقييم تحفيز الخلايا بصريًا. ابدأ بإذابة نكسات الريسوس PBMCs الأولية.
احتضان الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية مع التحريض لطيف حتى يبقى سوى كمية صغيرة من الجليد. ماصات بلطف الخلايا في أنبوب مخروطي. ثم شطف القارورة مع ملليلتر واحد من الوسط الأساسي و ببطء إضافته إلى الخلايا.
إضافة ببطء إضافية تسعة ملليلتر من المتوسطة الأساسية الدافئة إلى الخلايا. ضع الأنبوب في العبوة المقاومة للهباء الجوي والطرد المركزي بمعدل 600 مرة في غرام لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 22 درجة مئوية. التعرق وssuspend بيليه في كمية صغيرة من متوسطة النمو.
لحساب الخلايا، إضافة 10 ميكرولترات من الخلايا إلى 10 ميكرولترات من الأزرق trypan. قم بتحميل شريحة الغرفة وأدخلها في العداد. اضغط على زر الالتقاط لحساب الخلايا.
حساب العدد الإجمالي للخلايا بضرب تركيز الخلايا بالحجم وتخفيفها إلى مليوني خلية لكل ملليلتر في متوسط النمو. إضافة المضادة لـ CD28 لتركيز النهائي من خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر. ثم الماصات من ثلاثة إلى ستة ملايين خلية في البئر في لوحات مغلفة CD3 المضادة.
احتضان لوحات لمدة يومين في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. سخني جهاز طرد مركزي إلى 32 درجة مئوية عن طريق تشغيله عند 2,000 ضعف ز لمدة 30 دقيقة. وفي الوقت نفسه، دافئة على حد سواء خالية من المصل وسائل الإعلام والنمو في حمام الماء 37 درجة مئوية وذوبان الفيروس مع دوامة لطيف في حمام مائي 37 درجة مئوية.
ثم ضعه على الجليد. تخفيف الفيروس إلى تعدد الأمثل المحدد سلفا من العدوى في المتوسطة خالية من المصل. إضافة ملليلترين من الفيروس الرجعي المخفف إلى كل بئر من لوحة ليفية المغلفة باستخدام وسائل الإعلام وحدها لخلايا التحكم السلبية.
ضع اللوحات في جهاز الطرد المركزي المُسبق الارهاد في حاملات الصواح الصغيرة والطرد المركزي عند 2000 مرة من g لمدة ساعتين. إذا كان يستخدم على الفور، الاستنشاق إعداد الفيروس من الآبار وإضافة ملليلتر من متوسطة النمو. تحقق من PBMCs حفز تحت مجهر مقلوب.
يجب أن تكون الخلايا مستديرة ومشرقة وينبغي أن تنكس الضوء. وينبغي أن يكون لديهم أيضا مظهر متجمع تشير إلى التحفيز. جمع الخلايا المستهدفة ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
شطف كل بئر مرة واحدة مع ملليلتر واحد من متوسطة النمو وإضافة ذلك إلى الأنبوب. ثم عد الخلايا كما أظهرت سابقا. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي لهم في 600 مرة ز لمدة خمس دقائق في 32 درجة مئوية.
استلهم وسائل الإعلام من بيليه و resuspend الخلايا في وسط النمو بتركيز 1.5 مليون خلية لكل ملليلتر. إضافة ملليلتر واحد من تعليق الخلية إلى كل فيروس المغلفة جيدا وإضافة خلايا تحويل MAC إلى الآبار المغلفة ليفينيكتين التي لم تتلقى الفيروس. أجهزة الطرد المركزي لوحات في 1،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في 32 درجة مئوية واحتضانها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.
يتطلب العمل مع خلايا الريسوس وفيروسات غاما الرجعية استخدام معدات الحماية الشخصية مثل معاطف المختبرات والقفازات ويجب أن يتم العمل في خزانة السلامة البيولوجية. يجب تطهير جميع الماصات والحلول. ماشيت محتويات كل بئر صعودا وهبوطا مع ماصة ملليلتر خمسة لإعادة تعليق الخلايا ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
إضافة ملليلتر واحد من متوسطة النمو لكل بئر والماصات صعودا وهبوطا لإزالة الخلايا الملتصاة. ثم عد الخلايا كما سبق وصفها. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 600 مرة ز لمدة 10 دقائق في 25 درجة مئوية.
ثم تطن وسائل الإعلام و resuspend الخلايا في توسيع وسائل الإعلام إلى تركيز مليون خلية لكل ملليلتر. بذور خمسة ملليلتر من الخلايا في كل بئر الغاز نفاذية من لوحة ستة بئر وطبقة بعناية إضافية 25 ملليلتر من وسائل الإعلام التوسع في البئر. ثم احتضان الخلايا دون عائق في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربعة أيام.
لجمع الخلايا من الآبار، وإزالة وتجاهل 20 ملليلتر من وسائل الإعلام مع الحرص على عدم إزعاج الخلايا. الماصات وسائل الاعلام المتبقية صعودا وهبوطا لإزاحة الخلايا. استخدام ماصة نقل العقيمة لشطف كل بئر مع ثلاثة ملليلتر من وسائل الإعلام وجمع الخلايا المتبقية.
ثم عد لهم للتحقق من رقم الخلية ومقومات البقاء. وقد استخدم هذا البروتوكول في نقل وتوسيع الخلايا من ستة مختلفة. وتم زرع آبار الغاز القابلة للنفاذ بكثافة تبدأ من خمسة ملايين خلية، وبعد أربعة أيام من النمو، تم تحقيق كثافة متوسطة قدرها 55.6 مليون خلية في البئر.
أبقيت القدرة صلاحية من الخلايا يرصّد ب [تريبن] الإقصاء زرقاء كان في 83 [أو 95] ٪ طوال البروتوكول. تم استخدام قياس تدفق السيل لمراقبة التعبير المشترك للجينات المتحولة. في اليوم الخامس، تم نقل متوسط 42.8٪ من الخلايا مع كل من CD4-MBL CAR و CXCR5.
بينما في اليوم التاسع، كان متوسط التعبير 47.6٪ مع جولة واحدة من النقل. كما تم استخدام عملية استئصال التدفق لمراقبة النمط الظاهري للذاكرة. قبل النقل والتوسع، تم تحديد مجموعات الذاكرة المركزية الساذجة والذاكرة المنفذة.
فقد السكان الساذج مع زراعة وكانت الخلايا في المقام الأول خلايا الذاكرة المركزية في اليوم الخامس واليوم التاسع. ويعتمد النجاح في النقل على استخدام الكواشف عالية الجودة، والخلايا القابلة للحياة للغاية، وفيروس الثدي، فضلا عن اتباع توقيت البروتوكول باستمرار. يمكن استخدام الخلايا للفحوصات الوظيفية بما في ذلك الهجرة واختبارات قمع الفيروسية وكذلك للضخ في الحيوانات للدراسات قبل الإكلينيكية لاختبار فعالية العلاج المناعي.
لقد تقدمنا في الاختبار قبل الفحصي للخلايا التائية في الحيوانات وCXCR5 في الحيوانات ونأمل أن نختبر هذا العلاج المناعي قريبًا في الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية.
