يصف هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام يرقات الأسماك الوحشية المعدلة وراثيا لتوفير مقايسة كمية في الجسم الحي للورم xenograft الأوعية الدموية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التقنيات السابقة هي أنها تسمح للمحقق بتكميم التغيرات بدقة في مستويات الأوعية الدموية xenograft. وتتمثل الخطوة الرئيسية في ضمان حقن الخلايا السرطانية بشكل صحيح في يرقات أسماك الحمار الوحشي حتى لا يتم اختراق خطوات التصوير والكميات اللاحقة.
بعد نمو وتسمية خلايا B16-F1 مع صبغة الفلورسنت، ابدأ في إعداد الأجنة للزرع. ملء طبق 35 ملليمتر مع 2٪ ميثيلسيللوز في حل E3 إلى ربع حجم الطبق. باستخدام ماصة نقل، ضع ما يقرب من 50 الأجنة المعدلة وراثيا أعدت سابقا على ميثيل سيلولوز مع التقليل من حجم محلول E3 المنقولة.
باستخدام طرف ماصة ميكروكيلي، ترتيب الأجنة بحيث يتم توجيهها جميعا عموديا مع رؤوسهم إلى الأعلى، الذيول إلى أسفل، والجنين مع الجانب الأيسر لأعلى. إضافة 50٪ ECM إلى بيليه خلية B16-F1 أعدت سابقا لإنتاج خليط من الخلايا إلى ECM في نسبة اثنين إلى واحد. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب والتحريك، وتخزين الخليط على الجليد.
استخدام ماصة ميكروكريلا ل تناول ما يصل ثلاثة إلى 10 ميكرولترات من الخلايا. قم بإدخال طرف الماصات بعناية في إبرة الحقن المجهري المعدة مسبقًا، ثم أخرج خليط مصفوفة B16-F1 في نهاية الإبرة. أدخل الإبرة في حامل الإبرة، واميل بزاوية 45 درجة إلى الطبق.
استخدم ملاقط لكسر طرف الإبرة لجعل ثقب كبير بما يكفي لقذف الخلايا من الإبرة دون الضغط على الخلايا. بدوره على اسطوانة الهواء المضغوط تعلق على جهاز الحقن، ومن ثم تشغيل حاقن للحظات على الوضع المستمر لمدة لا تزيد عن ثانية واحدة لدفع الخلايا إلى طرف الإبرة. صوب الإبرة نحو كيس الصفار للجنين ، وادفعها عبر كيس الصفار في اتجاه البطن حتى يخرج طرف الإبرة من كيس الصفار ويدفع البشرة الجنينية على الجانب البطني للجنين ، فقط في الجزء الخلفي من القلب.
دفع بعناية وقليلا غيض من الإبرة إلى الأمام حتى أنها خلقت مساحة صغيرة بين البشرة والغشاء كيس صفار. نبض حاقن لإخراج بعض من خليط الخلية في هذا الفضاء ما بينتين. ننظر بعناية في حجم وشكل وموقع xenograft كما يجري زرعها، وضبط عدد النبض وموقف الإبرة وفقا لذلك لضمان xenograft زرعها بشكل صحيح.
كرر البقول حتى تم حقن 500 إلى 800 خلية في الفضاء ما بين 455 و 450 خلية في الفضاء ما بين 450 و 500 خلية، مما يخلق انتفاخا مرئيا يمتد نصف الطريق على الأقل على طول الجزء السفلي من كيس الصفار. إزالة الإبرة من الجنين. بعد حقن جميع الأجنة، استخدم طرف ماصة ميكروكيلير لدفع جميع الأجنة معا بحيث يمكن أن pipetted بها مع أقل قدر ممكن من الميثيل.
نقل الأجنة في طبق الانتعاش التي تحتوي على E3 مع PTU والميثلين الأزرق. ثم الماصات برفق E3 حول الأجنة لغسلها، ومن ثم احتضان في 34 درجة مئوية. ثم صورة الأجنة المُغَدَّة باستخدام مجهر مُكَنَّف.
استخدم قناة ليزر مناسبة للخلايا السرطانية لتحديد حجم يتم تصويره، مما يسمح بواحد أو قسمين بصريين على الأقل على جانبي الكسب غير المشروع. استخدم فواصل الأقسام الموجودة حول خمسة ميكرومترات عن بعضها البعض لإنشاء مكدس Z. استخدم التصوير على قناتين لتصوير كل من الأوعية الدموية والورم xenograft.
صورة الورم xenograft والأوعية الدموية ليرقة واحدة، وتكرار هذه الخطوات لكل يرقة أن تكون صورة. لتبدأ مع كمية من استجابة angiogenic إلى xenograft حمار وحشي، نقل التي تم إنشاؤها سابقا Z كومة ملفات الصور confocal من xenograft الورم إلى مجلد جديد على برنامج تحليل الصور 3D. لإنشاء بروتوكول وحدة تخزين الورم لقياس حجم xenograft الورم، انتقل إلى علامة التبويب القياس في القائمة العلوية من النافذة، ثم من قائمة البروتوكولات التي تظهر اسحب البروتوكول المسمى العثور على كائنات إلى المساحة التي تحمل عنوان "سحب المهام هنا لإجراء القياسات".
بعد التأكد من أن هذا البروتوكول هو تعيين لقياس الكائنات في قناة الورم، اسحب البروتوكولات المسماة مقطع إلى ROIs وجعل العائد على الاستثمار من السكان من قائمة البروتوكولات إلى سحب المهام هنا لجعل قياسات الفضاء، مع التأكد من أن هذين الأمرين تنطبق على الكائنات التي تم التعرف عليها من قبل كائنات البحث. قبل معايرة إعدادات هذا البروتوكول، انتقل إلى القائمة المنسدلة أعلى تسمية الوضع في أعلى يسار النافذة، وحدد طريقة العرض Extended Focus. قم بإلغاء تحديد القنوات غير الورمية في الجزء الموجود في أقصى اليمين بالنقر فوق الدائرة السوداء تحت كل عنوان قناة بحيث يمكن رؤية قناة الورم فقط.
ثم استخدم أداة حر في الجزء العلوي من النافذة لرسم منطقة من الاهتمام، أو ROI، حول كل من حجم الورم. في اللوحة أسفل الصورة، حدد تسمية الملخص، ثم قم بتعيين خيار العرض لإظهار عدد السكان الثاني. لمعايرة، على البحث عن الكائنات المهمة، انقر فوق العلامة النجمية لفتح إطار الإعدادات.
ضبط عتبة باستخدام كثافة، وتحديد عتبة أقل حتى يتم تحديد الخلايا السرطانية فقط وليس الفلورسيس الخلفية. تحديد الحد الأدنى لحجم الجسم بحيث يتم قياس الخلايا السليمة فقط، على عكس العناصر الأصغر من حطام الخلية، عن طريق تعيين الحد الأدنى لحجم الجسم كميكرومتر مكعب 100. حفظ هذا البروتوكول كما حجم الورم عن طريق النقر على علامة التبويب القياسات في القائمة العلوية والنقر حفظ البروتوكول.
استخدم نفس الإعدادات لقياس كافة xenografts. لقياس حجم الأوعية الدموية المرتبطة بـ xenograft، قم بإنشاء بروتوكول جديد من خلال الانتقال إلى القائمة العلوية ثم النقر فوق علامة التبويب القياسات ثم مسح البروتوكول. اسحب المهام البحث عن الكائنات والقص إلى ROIs في المساحة التي يتم بعنوان سحب المهام هنا لإجراء القياسات لهذا البروتوكول.
تأكد من أن الأمر الأول تم تعيينه لقياس الكائنات في قناة الأوعية الدموية وأن الأمر التالي تم تعيينه لتطبيقه على الكائنات التي تم التعرف عليها من قبل الأمر الأول. ثم قم بإلغاء تحديد القنوات غير الوعاءية في الجزء الأيمن الأقصى بحيث يمكن رؤية الأوعية الدموية فقط. تحديد إعدادات بروتوكول حجم السفينة بطريقة مشابهة للبروتوكول حجم الورم الموصوف سابقا، وحفظ هذا البروتوكول كما حجم السفينة.
مسح البروتوكول، ورسم عائد الاستثمار حول xenograft، مع الحرص على عدم تضمين أي عدم الورم التلقائي. لقياس مجموع حجم الكائنات في قناة الورم داخل عائد الاستثمار هذا، انقر فوق علامة التبويب القياسات، وحدد أمر استعادة البروتوكول، واختر بروتوكول وحدة تخزين الورم، وانقر فوق استعادة. باستخدام عائد الاستثمار الجديد الذي تم إجراؤه بواسطة بروتوكول حجم الورم، انقر فوق علامة التبويب القياسات وحدد أمر استعادة البروتوكول، واختر بروتوكول وحدة التخزين للسفينة، وانقر على صف المجموع لحساب إجمالي حجم الكائنات في قناة السفينة داخل عائد الاستثمار هذا.
تقسيم حجم السفينة على حجم الورم، وضرب الإجابة من قبل 100 للحصول على قيمة مئوية من الكسب غير المشروع الأوعية الدموية. من خلال تصوير xenograft الفردية في ست، 24، و 48 ساعة بعد زرع، يمكن حساب استجابة الأوعية الدموية في أوقات مختلفة، مع أكبر استجابة ائية بين 24 إلى 48 ساعة بعد زرع والمستويات القصوى من الكسب غير المشروع الأوعية الدموية ينظر حوالي 48 ساعة. يظهر التصوير المقطعي للوقت من B16-F1 xenograft المزروعة في جنين حمار وحشي بعد يومين بعد الإخصاب الأوعية الدموية التي تحمل علامة GFP تنمو من خلال xenograft ، مما يشكل شبكة التواء مع أوعية ذات حجم غير منتظم ومورفولوجيا نموذجية لشبكة الأوعية الدموية غير الطبيعية التي شوهدت في أورام الثدييات.
Xenografts المحتضنة في مثبط VEGFR تظهر انخفاض كبير في السفينة مقارنة مع السيطرة xenografts المحتضنة في DMSO. في الأجنة السيطرة، كان هناك شبكة الأوعية الدموية توسعية تمتد عبر منطقة xenograft بأكملها، واستجابة أوعية نموذجية لوحظ بعد زرع خلايا B16-F1. عند تحديد كميا، تظهر استجابة أوعية الأوعية الدموية انخفاضا واضحا في الأوعية الدموية الكسب غير المشروع في xenografts مثبطات VEGFR المعالجة بالمقارنة مع الضوابط.
تظهر قناة الورم كتلة من خلايا B16-F1 المسماة بفلورسنت تحت كيس الصفار، والذي يعرض الفلورس التلقائي. لذلك، يجب أن يتم رسم عائد الاستثمار بعناية حول xenograft، مع الحرص على عدم تضمين أي من autofluorescence من كيس الصفار. حدد بروتوكول حجم الورم جميع خلايا B16-F1 في عائد الاستثمار، وقاس حجمها، وقص عائد الاستثمار إلى حجمها.
سمح بروتوكول حجم وعاء الورم في هذا العائد على الاستثمار المقصوص الجديد بتحديد جميع الأوعية المرتبطة بتكتل خلايا B16-F1 وقاس حجمها. يمكن استخدام القيم من حجم الورم وبروتوكولات حجم الأوعية الورم لإعطاء قدر من الكسب غير المشروع الأوعية الدموية. تسمح قابلية الزمر الوراثي ونفاذية سمك الحمار الوحشي بالتحقيق في مسارات الإشارات العالية في تولد الأوعية الدموية ، ويمكن أن تكون أيضًا بمثابة منصة فحص لتحديد المركبات المضادة للأوعية.
