نشكر أتسوشي ميياواكي وحماه هيروشي لمشورتها على تجارب هلأبسكا، تشارلز يوكوياما لتحرير المخطوطة، Eriko Ohshima وكيشينو ميوكي للمساعدة التقنية التي تقدمها. هذا العمل كان تدعمها أموال البحوث من بتبريد T.H. ومعونة "البحث العلمي" من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون) من اليابان إلى T.H. (المجالات المبتكرة "Mesoscopic نيوروسيركويتري"؛ 22115004) و س. س. (25890023).

وافقت عليها اللجنة التجارب الحيوانية واكو بتبريد والتجربة المؤتلف الوراثية بتبريد سلامة اللجنة جميع الإجراءات التجريبية وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية من مرافق الحيوانات العلوم الدماغ بتبريد المعهد.
1-التحضير للتصوير الدوائر
<ol><li>
تصوير الدائرة19
	<ol>
<li>استخدام أوراق المطاط سيليكون، إعداد دائرة بسمك حوالي 5 مم والطابق لوحات من سمك مختلف. كما أن إعداد أطباق بيتري مع أو بدون من أسفل زجاج (الشكل 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
فاصل شريحة
	<ol>
<li>إعداد الفواصل لإجراء عينات، واستخدام أوراق المطاط سيليكون بسمك 0.5 ملم (الشكل 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-الراسم حقن
ملاحظة: إجراء الحقن في بونس (2.1) أو متفوقة والاكيميه (2.2). حقن في الخلايا العصبية الدماغية دون إسقاط التسمية بونس في منطقة واسعة من الدماغ بما في ذلك في المناطق البصرية والحركية، في حين حقن في الخلايا العصبية الدماغية دون إسقاط تسميات والاكيميه متفوقة في المجال المرئي. لمراقبة التجارب، حقن المحلول الملحي بدلاً من الكوليرا المسمى فلوريسسينتلي السمية فرعية ب للحفاظ على حالة معقمة استخدام معدات معقمة وقفازات بلاستيك تنظيفها مع الإيثانول.
<ol><li>
جعل الحقن إلى بونس من الفئران الكبار.
	<ol>
<li>رسم 1 ميليلتر الكوليرا المسمى فلوريسسينتلي السمية فرعية ب (25 ميكروغرام/ميليلتر في برنامج تلفزيوني) في محقن هاملتون ز 26.</li>
		<li>مكان مضخة حاقن في المحاقن.</li>
		<li>وضع المحقن ومضخة على حامل أداة مناور وضعها في أداة ستيريوتاكسيك. إمالة مناور 12 درجة جيدة من المحور العمودي.</li>
		<li>تخدير ماوس البالغين الذكور أو الإناث (C57BL/6J أو Tlx3-cre/Ai9) عن طريق حقن بينتوباربيتال الصوديوم إينترابيريتونيلي (60 مغ/كغ من وزن الجسم) أو عن طريق إدارة إيسوفلوراني (2-3%). انتظر حتى الماوس يجعل أي استجابة عندما يتم مقروص ذيله مع الملقط، مما يشير إلى أن يتم تخديره الماوس تماما.</li>
		<li>ضع الماوس على الأداة ستيريوتاكسيك.</li>
		<li>بعناية إزالة الشعر باستخدام شفرة حلاقة لمنع العدوى وقطع 10 ملم من فروة الرأس حيث أن بريجما وامدا مرئية. إدارة 0.1 مل يدوكائين 1% استخدام ماصة. تعيين زاوية الرأس بضبط الموضع العمودي للناطقة باسم الصك ستيريوتاكسيك حيث يكون بريجما وامدا نفس المستوى z.</li>
		<li>ضبط موضع المناور بتحريكه على الصك ستيريوتاكسيك حيث يكون غيض المحاقن قريبة بريجما وتسجيل موقف المناول. سحب المحاقن بتحريك حامل أداة على المناور.</li>
		<li>الانتقال المناور 5.4 مم الخلف و 0.4 ملم أفقياً. تقدم المحاقن حيث أن التلميح يقع بالقرب من نقطة دخول في الجمجمة. سحب المحاقن، وعلامة نقطة الإدخال.</li>
		<li>في موقف واضح، حفر حفرة قطرها حوالي 1 مم.</li>
		<li>إدراج تلميح حقنه من خلال الثقب حيث يكون عمق نصيحة 6.9 ملم أكثر من أن تقاس في بريجما.</li>
		<li>حقن 1 ميليلتر لتتبع استخدام المضخة في 0.2 ميليلتر/دقيقة.</li>
		<li>إزالة المحاقن من الدماغ.</li>
		<li>إذا لزم الأمر، تغطي الدماغ المكشوفة بشظايا صغيرة من هيموستات ميكروفيبريلار ولاصق الفورية.</li>
		<li>شطف في الدماغ يتعرض استخدام المحلول الملحي تسليمها مع ماصة لمنع العدوى وخياطة فروة الرأس.</li>
		<li>إزالة الماوس من الصك ستيريوتاكسيك. تسمح الماوس للتعافي من التخدير في حاضنة في ˚C 30، عادة ح 1. لا تترك الماوس غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. العودة الماوس لشركة الحيوانات الأخرى بعد قد تعافي تماما.</li>
		<li>الحفاظ على الماوس لمدة 3 – 7 أيام.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إجراء الحقن في والاكيميه متفوقة من الفئران الكبار.
	<ol>
<li>إعداد ماصة زجاج نصيحة قطرها 30-50 ميكرون.</li>
		<li>قم بتوصيل ماصة زجاجية حقنه هاميلتون عن طريق أنبوب بلاستيكي (الشكل 2A).</li>
		<li>تعبئة ماصة زجاجية وأنبوب من البلاستيك، والمحاقن هاملتون بالسائل البارافين.</li>
		<li>مكان مضخة حاقن في المحاقن.</li>
		<li>ضع ماصة زجاجية على المناور وآماله مناور 60 درجة جيدة من المحور الرأسي (الشكل 2).</li>
		<li>أداء 2.1.4–2.1.9. وموقف المناور 1.4 مم الخلفي، الجانبي 0.5 مم إلى لامدا.</li>
		<li>ضع فيلم بارافين بلاستيكية صغيرة في الجمجمة، ثم وضع حوالي 1 ميليلتر من الحل الراسم على ذلك. بسرعة تقدم ماصة زجاجية وملء مع مالا يقل عن 0.5 ميليلتر من الحل الراسم.</li>
		<li>إدراج الماصة الزجاجية حيث يكون عمق نصيحة 3.0 مم من سطح الدماغ.</li>
		<li>حقن 0.5 ميليلتر لتتبع استخدام المضخة في 0.2 ميليلتر/دقيقة.</li>
		<li>إزالة ماصة زجاجية من الدماغ.</li>
		<li>أداء 2.1.13–2.1.16.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3-التثبيت والتشذيب
<ol><li>حقن الصوديوم بينتوباربيتال (60 مغ/كغ من وزن الجسم) إينترابيريتونيلي ماوس (C57BL/6J أو Tlx3-/Ai9لجنة المساواة العرقية، مع أو بدون حقن التتبع كما هو موضح في الخطوة 2. انتظر حتى الماوس يجعل أي استجابة عندما يتم مقروص ذيله مع الملقط، مما يشير إلى أن يتم تخديره الماوس تماما.</li>
	<li>Euthanize الماوس إنسانية قبل بيرفوسينج ترانسكارديالي الماوس20 مع المالحة 0.9 في المائة.</li>
	<li>إصلاح الماوس20 من بيرفوسينج بارافورمالدهيد 4% (PFA) في المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 M (درجة الحموضة 7.5).</li>
	<li>
قص فروة الرأس باستخدام مقص لفضح الجمجمة ك وصف20.
	<ol>
<li>قطع خط الوسط الجمجمة المكشوفة باستخدام زوج من مقص. إزالة الجمجمة باستخدام الملقط.</li>
		<li>إذا كان من الضروري تمييز موقف بريجما وامدا، قم أولاً بإزالة واحدة نصف الكرة الأرضية للجمجمة. إدراج الإبر التنغستن رقيقة في الدماغ في مواقف بريجما وامدا في الجمجمة المتبقية على الدماغ، ثم إزالة الجمجمة المتبقية. ملاحظة: يمكن تخزين الدماغ في برنامج تلفزيوني في 4 ˚C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
القيام بتلوين الأجسام المضادة للخلايا العصبية المثبطة، قطع عينات المخ إلى شرائح.
	<ol>
<li>وضع العينة الدماغ على فيبرتوم.</li>
		<li>قطع شرائح يصل إلى 500 ميكرومتر سميكة في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة، والانتقال إلى الخطوة 5 (أبسكاله أسلوب).</li>
	</ol>
</li>
	<li>إذا كان جسم تلطيخ لا لزوم لها، عينة الدماغ لكتل تريم (تصل إلى 3 مم) باستخدام شفرة حلاقة (الشكل 3)، والانتقال إلى الخطوة 4 (أسلوب سيدب). ملاحظة: المخ يمكن تخزين في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية بعد القص أو التشذيب. الأسلوب سيدب الأفضل عندما تلطيخ جسم ليس ضروريا لأنه يتطلب وقتاً أقل من أسلوب هلأبسكا.</li>
</ol>4-تطهير دون جسم تلطيخ (أسلوب سيدب)
<ol><li>نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل من 0.5% α-ثيوجليسيرول وسكر 20% (w/v) واحتضان من أجل ح 4 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل α-ثيوجليسيرول 0.5% وسكر الفواكه 40% (w/v) واحتضان من أجل ح 4 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل من 0.5% α-ثيوجليسيرول وسكر 60% (w/v) واحتضان من أجل ح 4 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل من 0.5% α-ثيوجليسيرول وسكر 80% (w/v) واحتضان من أجل ح 12 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل من 0.5% α-ثيوجليسيرول وسكر 100% (w/v) واحتضان من أجل ح 12 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل من 0.5% α-ثيوجليسيرول وسكر 80.2% (w/w) واحتضان من أجل 24 ساعة مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: التعامل مع العينة بعناية للحفاظ على تشوهات صغيرة بقدر الإمكان. عدم احتضان عينات أطول مما ورد، كعينات يمكن أن تصبح بسرعة غير شفاف.</li>
	<li>تضمين العينة في دائرة تصوير لشغلها مع الحل سكر 80.2 في المائة (الشكل 1B). إذا لزم الأمر، إصلاح العينة بوضع القطع الصغيرة من المطاط لاصق حولها. إذا كانت الدائرة عميق جداً، وضعت صفيحة الكلمة في الدائرة قبل وضع العينات.</li>
	<li>ضع طبق بيتري مع غطاء زجاج في قاعة التصوير ووضع الماء في طبق، والصورة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل] أو اثنين-فوتون مع غمر مياه تعمل منذ فترة طويلة المسافة والهدف. ويرد في الجدول 1موجات الإثارة وعوامل الانبعاثات. إذا لزم الأمر، استخدم مرحلة إليه.</li>
</ol>5-تطهير مع جسم تلطيخ (أبسكاله أسلوب)
<ol><li>إعداد الكواشف كما هو موضح في الجدول 2.</li>
	<li>نقل الشرائح باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيك 5 مل تحتوي على 4 مل من محلول Sca/eS0 واحتضانها لهم ح 12 مع الهز لطيف في 37 درجة مئوية (الشكل 4 باء).</li>
	<li>إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة وإضافة 4 مل من محلول Sca/eA2، واحتضان الشرائح من ح 36 مع الهز لطيف في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة وإضافة 4 مل من محلول Sca/eB4، واحتضان الشرائح من 24 ساعة مع الهز لطيف في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة وإضافة 4 مل من محلول Sca/eA2، واحتضان الشرائح من ح 12 مع الهز لطيف في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني واحتضان الشرائح من ح 6 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>بعناية إزالة الشرائح إلى أنبوب بلاستيكي 2 مل باستخدام ملعقة.</li>
	<li>احتضان مع الأجسام الأولية (الجدول 3) في 1 مل من أبسكاله حل ح 48-72 في 37 درجة مئوية (الشكل 4) مع الهز لطيف.</li>
	<li>بعناية إزالة الشرائح إلى أنبوب بلاستيك 5 مل باستخدام ملعقة.</li>
	<li>تبني في 4 مل من أبسكاله حل ح 2 2 مرات في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف.</li>
	<li>بعناية إزالة الشرائح إلى أنبوب بلاستيكي 2 مل باستخدام ملعقة.</li>
	<li>احتضان مع المسمى فلوريسسينتلي الثانوي الأجسام المضادة (الجدول للمواد، 1: 100) في 1 مل من أبسكاله حل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف.</li>
	<li>بعناية إزالة الشرائح باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيك 5 مل تحتوي على 4 مل من أبسكاله الحل واحتضان الشرائح من ح 6 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة إضافة 4 مل من أبسكاله الحل واحتضان الشرائح من ح 2 2 مرات مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة وإضافة 4 مل 4% منهاج عمل بيجين، واحتضان الشرائح من ح 1 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني واحتضان الشرائح من ح 1 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة وإضافة 4 مل الحل Sca/eS4، واحتضان الشرائح من ح 12 مع الهز لطيف في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>مكان فاصل على شريحة زجاجية ووضع الشرائح في المباعدة وتزج الشرائح مع الحل Sca/eS4. ختم فاصل مع زجاج الغطاء (الشكل 1).</li>
	<li>وضع المياه في تغطية الزجاج والصورة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل] أو اثنين-فوتون مع غمر مياه تعمل منذ فترة طويلة المسافة والهدف. إذا لزم الأمر، استخدم مرحلة إليه. ملاحظة: التحقق من ما إذا كانت الأجزاء العميقة من العينة المسماة المثل إلى أجزاء سطحية للتأكد من عدم وجود تحيز كبير وضع العلامات. ملاحظة: يتم وصف الاختراق من الأجسام المضادة التي تم اختبارها في الجدول 3.</li>
</ol>6-خلية تحديد الموقع
<ol><li>لكل موقف في الصور الممسوحة ضوئياً، حساب قيم الارتباط باستخدام تصفية صورة ثلاثية الأبعاد14 (الشكل 5A-5D).</li>
	<li>تحديد مواقف قمم قيمة الارتباط (الشكل 5).</li>
	<li>التحقيق الصور حول قمم لتحديد موقع الخلايا (الشكل 5E).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li><li>Defelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons.">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), aac9462 (2015).</li><li>Sorensen, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+gene+expression+and+target+specificity+demonstrate+excitatory+projection+neuron+diversity.">Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity.</a> Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347, 1138-1142 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+Challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li><li>Horton, J. C., Adams, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cortical+column:+a+structure+without+a+function.">The cortical column: a structure without a function.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).</li><li>Costa, N. M., Martin, K. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whose+cortical+column+would+that+be?.">Whose cortical column would that be?.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, (2010).</li><li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex.">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).</li><li>Hioki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+inhibitory+inputs+to+dendritic+and+somatic+compartments+of+parvalbumin-expressing+neocortical+interneuron.">Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron.</a> Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).</li><li>Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+organization+of+a+major+subtype+of+pyramidal+neurons+in+neocortical+layer+V.">Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V.</a> Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).</li><li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-dependent+posttranscriptional+regulation+of+NOS1+by+FMRP+in+the+developing+cerebral+cortex.">Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex.</a> Cell. 149 (4), 899-911 (2012).</li><li>Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+system+of+functionally+distinct+cell+types+in+the+neocortex.">Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex.</a> Science. 358 (6363), 610-615 (2017).</li><li>Treweek, J. B., Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+structural+and+functional+features+of+widely+distributed+biological+circuits+with+single+cell+resolution+via+tissue+clearing+and+delivery+vectors.">Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors.</a> Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Principles+in+Tissue+Clearing+and+Staining+Protocols+for+Whole-Body+Cell+Profiling.">Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).</li><li>Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENSAT+BAC+cre-recombinase+driver+lines+to+study+the+functional+organization+of+cerebral+cortical+and+basal+ganglia+circuits.">GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Kim, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules.">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+scalable+proteomic+imaging+for+high-dimensional+profiling+of+intact+systems.">Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li><li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+mapping+of+neuronal+circuitry+with+an+index-optimized+clearing+agent.">Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent.</a> Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6, 18631 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution.">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li><li>Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex,+quantitative+cellular+analysis+in+large+tissue+volumes+with+clearing-enhanced+3D+microscopy+(Ce3D).">Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).</li><li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

وقد قدمنا إجراءات للحصول على صور ثلاثية الأبعاد الواسعة النطاق للمنظمة خلية نوع معين من أنواع الخلايا الرئيسية في طبقة نيوكورتيكال الماوس 5. مقارنة لتلطيخ شريحة التقليدية، يكون الأسلوب أكثر فائدة في تحديد منظمة ثلاثية الأبعاد من اللحاء الجديد. الأسلوب الذي يتيح الحصول على الصور من نطاق أ...

اللحاء الجديد الثدييات يتكون من عدد كبير من أنواع الخلايا، كل مع أنماط التعبير الجيني محددة، الخصائص البيوكيميائية والكهربية، والاتصالات متشابك، و في فيفو وظائف1،2 ،3،،من45،،من67. ما إذا كان يتم تنظيم أنواع هذه الخلية في هياكل المتكررة كانت غير واضحة. أعمدة القشرية، بما في ذلك الأعمدة المرئية التوجه وبرميل somatosensory، كررنا الهياكل، ولكن منظمتهم الخلوية ما زال غير واضح8،9. هذه موجودة في المناطق القشرية محددة ولا نظام على مستوى الدماغ.
وتصنف في طبقة نيوكورتيكال 5، الغالبية العظمى من الخلايا العصبية إلى أربعة أنواع رئيسية. نوع رئيسي من ضادات الخلايا العصبية، الخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط، مشاريع محاور عصبية لأهداف subcortical منها بونس والحبل الشوكي، ووالاكيميه متفوقة، وعليه، يمثل مسار الإخراج القشرية الرئيسية10. الإسقاط القشرية الخلايا العصبية، نوع رئيسي آخر من ضادات الخلايا العصبية، يعصب قشرة10. الخلايا العصبية المثبطة تحتوي أيضا على الفئات الرئيسية هما: الخلايا الإعراب عن بارفالبومين والإعراب عن سوماتوستاتين11.
وتشير التحليلات الأخيرة إلى أن يتم تنظيم أنواع الخلايا الأربع في هياكل المتكررة12،،من1314. تنظيم الإسقاط الدماغي دون الخلايا العصبية12،،من1314 والإسقاط القشرية الخلايا العصبية14 في ميكروكولومنس نوع من الخلايا المحددة التي يبلغ قطرها 1-2 الخلايا. محاذاة الخلايا الإعراب عن بارفالبومين والإعراب عن سوماتوستاتين على وجه التحديد مع ميكروكولومنس من الخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط ولكن ليس مع ميكروكولومنس من الإسقاط القشرية الخلايا العصبية14. ميكروكولومنس أنفسهم محاذاة دورياً للنموذج سداسية شعرية الصفيف14 وهي موجودة في المناطق القشرية متعددة بما في ذلك المناطق المرئية وسوماتوسينسوري والحركية في الدماغ الماوس12،14 وفي اللغة مناطق الدماغ البشري13. الخلايا العصبية في microcolumn الفردية، معرض الأنشطة المتزامنة واستجابات حسية مشابهة14. هذه الملاحظات تشير إلى أن تنظيم الطبقة 5 أنواع الخلايا في بنية شعرية microcolumn الذي يمثل أول منظمة على مستوى الدماغ المعروفة من تكرار وحدات وظيفية.
ميكروكولومنس دائرة نصف قطرها حوالي 10 ميكرون ويكون تواتر مكانية لحوالي 40 ميكرومتر. وبالإضافة إلى ذلك، اتجاه ميكروكولومنس موازية dendrites قمي والتغييرات تبعاً لموقفها في قشرة14. ولذلك، من الصعب النظام microcolumn لتحليل استخدام شرائح القشرية التقليدية مع سمك نموذجي من بضع عشرات من ميكرومتر. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب تحليل تواتر البيانات ثلاثية الأبعاد من مجموعة واسعة من مناطق الدماغ، وبالتالي، منطقة التصوير نموذجية للفحص المجهري [كنفوكل] أو في فيفو التصوير 2-فوتون ضيقة للغاية.
في الآونة الأخيرة، تم وضع تقنيات لمسح أنسجة سميكة15،16. هنا يصف لنا تطبيق هذه الأساليب للحصول على صور ثلاثية الأبعاد على نطاق واسع، ومن أنواع الخلايا الرئيسية في طبقة نيوكورتيكال الماوس 5 التي تشمل نظام microcolumn. الإسقاط سوبسيريبرال الخلايا العصبية المسماة بالتالي إلى الوراء أو بالتعبير عن البروتين الفلورية الخضراء المعززة في الفئران المعدلة وراثيا اجفب كريم 12، والإسقاط القشرية المسماة الخلايا العصبية التي أما رجعية وضع العلامات أو بتعبير تدتوماتو في Tlx3-لجنة المساواة العرقية/Ai9 الفئران17. الإعراب عن بارفالبومين والإعراب عن سوماتوستاتين الخلايا المسماة إيمونوهيستوتشيميستري. يستخدم الأسلوب (جسم مقياس S) أبسكاله18 لجسم تلطيخ التجارب، في حين يتم استخدام أسلوب سيدب (انظر الدماغ العميق)19 لتجارب أخرى. التغلب على الصعوبات المشار إليها أعلاه من أساليب التصوير التقليدية هذه الأساليب وتكشف عن تنظيم طبقة 514دقيقة الخلوي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Crym-egfp transgenic mice</td>
			<td>MMRRC</td>
			<td>012003-UCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tlx3-cre transgenic mice</td>
			<td>MMRRC</td>
			<td>36547-UCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROSA-CAG-flox-tdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX #7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-01</td>
			<td>0.5 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-02</td>
			<td>1.0 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-05</td>
			<td>3.0 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C022241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>701N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>KDS 310</td>
			<td>Pons injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>KDS 100</td>
			<td>Superior colliculus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SM-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>Somnopentyl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>AstraZeneca</td>
			<td>Xylocaine injection 1% with epinephrine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Toyo Associates</td>
			<td>HP-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avitene microfibrillar hemostat</td>
			<td>Davol Inc</td>
			<td>1010090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alonalfa</td>
			<td>Daiichi-Sankyo</td>
			<td>Alonalpha A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K881H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>UVP</td>
			<td>HB-1000 Hybridizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Liquid, light</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>26132-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Otsuka</td>
			<td>1326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>26126-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needle</td>
			<td>Inter medical</td>
			<td>&#934;0.1 *L200 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL plastic tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-thioglycerol</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>33709-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(-) Fructose</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>16315-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BluTack</td>
			<td>Bostik</td>
			<td>CKBT-450000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1RMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td colspan="2">CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>COMS</td>
			<td>PT100C-50XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-492/SP-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF03-525/50-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF03-575/25-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-629/56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>D605/55m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL plastic tube</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>VIO-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL plastic tube</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35905-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glyserol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>191612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(-)-sorbitol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-14735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Tokyo chemical industry</td>
			<td>M1356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Cyclodextrin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>037-10643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-hydroxyproline</td>
			<td>Skin Essential Actives</td>
			<td>33996-33-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>13445-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (1.1 g/mL)</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35624-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABN78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTIP2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Statb2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD67</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GABA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Swant</td>
			<td>235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Frontier Institute</td>
			<td>PV-Go-Af460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Somatostatin</td>
			<td>Peninsula Laboratories</td>
			<td>T-4103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-c-Fos</td>
			<td>CalbioChem</td>
			<td>PC38</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale three-dimensional imaging of cellular organization in the mouse neocortex

يتكون اللحاء الجديد الثدييات من أنواع عديدة من الخلايا العصبية ضادات والمثبطة، كل منها مع الخصائص الكهربية والبيوكيميائية، اتصالات متشابك، و في فيفو الوظائف، ولكن الأساسية الوظيفية والتشريحية المنظمة من الهاتف الخلوي إلى نطاق الشبكة هو غير مفهومة. هنا يصف لنا طريقة لتصوير ثلاثي الأبعاد من الخلايا العصبية المسماة فلوريسسينتلي عبر مناطق واسعة من الدماغ لتحقيق المنظمة الخلوية القشرية. أنواع معينة من الخلايا العصبية المسماة بحقن الفلورسنت تتبع الخلايا العصبية إلى الوراء أو تعبير البروتينات الفلورية في الفئران المعدلة وراثيا. عينات كتلة الدماغ، مثلاً، نصف الكرة الغربي، أعد بعد التثبيت، التي تتسم بالشفافية مع أنسجة تطهير الطرق، ويتعرضون إلى إيمونولابيلينج الفلورية لأنواع محددة من الخلايا. يتم تفحص مناطق كبيرة باستخدام مجاهر [كنفوكل] أو اثنين-فوتون مجهزة بعمل كبير المسافة الأهداف والمراحل مزودة بمحركات. هذا الأسلوب يمكن حل المنظمة الدوري microcolumn الخاصة بنوع الخلية الوحدات الوظيفية في اللحاء الجديد الماوس. يمكن أن يكون هذا الإجراء مفيداً لدراسة البنية الخلوية ثلاثية الأبعاد في مجالات متنوعة من الدماغ والأنسجة المعقدة الأخرى.

نحن المسماة الخلايا العصبية القشرية الإسقاط بالتعبير عن تدتوماتو في Tlx3-لجنة المساواة العرقية/Ai9 الفئران المحورة وراثيا وتصور الخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط عن طريق حقن الراسم إلى الوراء CTB488 في بونس. تعرضت للأسلوب سيدب نصف الكرة الأيسر من الدماغ وتفحص با?...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex at JoVE.com

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

تصوير ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع من المنظمة الخلوية في اللحاء الجديد الماوس

هنا يصف لنا إجراء لإزالة الأنسجة ووسم الفلورسنت والتصوير على نطاق واسع لانسجة المخ الماوس الذي، وبالتالي يمكن تصور منظمة ثلاثية الأبعاد لأنواع الخلايا في اللحاء الجديد.

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

large-scale-three-dimensional-imaging-cellular-organization-mouse

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Views.  RIKEN Brain Science Institute. هنا يصف لنا إجراء لإزالة الأنسجة ووسم الفلورسنت والتصوير على نطاق واسع لانسجة المخ الماوس الذي، وبالتالي يمكن تصور منظمة ثلاثية الأبعاد لأنواع الخلايا في اللحاء الجديد.

Video: Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

متعددة الماوس تشريحي عصبي التصوير بالرنين المغناطيسي

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

تسجيل على نطاق واسع اطقم متعلق بالخلايا العصبية مع مجسات للسيليكون في الجرذ خدر

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

على نطاق واسع التسجيل من الخلايا العصبية بواسطة مجسات سيليكون المنقول في يتصرفون القوارض

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

الوقت الفاصل بين التصوير للهجرة أرومة عصبية في شرائح الدماغ الأمامي الحاد للماوس الكبار

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

التصوير كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; حيوية في محطات المخروط مبصرة أكسون من شبكية العين الفأر

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

بروتوكول للثلاثي الأبعاد متحد البؤر تحليل المظهرية من النجمية

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

تصوير ثلاثي الأبعاد وتحليل الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية إينترايبيديرمال البشرية

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and neurodegenerative diseases. Although numerous studies of axons have been conducted, our understanding of formation and dysfunction of axon fascicles is still limited due to the lack of robust three-dimensional in vitro models. Here, we describe a step-by-step protocol for the rapid generation of a motor nerve organoid (MNO) from human induced pluripotent stem (iPS) cells in a microfluidic-based tissue culture chip. First, fabrication of chips used for the method is described. From human iPS cells, a motor neuron spheroid (MNS) is formed. Next, the differentiated MNS is transferred into the chip. Thereafter, axons spontaneously grow out of the spheroid and assemble into a fascicle within a microchannel equipped in the chip, which generates an MNO tissue carrying a bundle of axons extended from the spheroid. For the downstream analysis, MNOs can be taken out of the chip to be fixed for morphological analyses or dissected for biochemical analyses, as well as calcium imaging and multi-electrode array recordings. MNOs generated with this protocol can facilitate drug testing and screening and can contribute to understanding of mechanisms underlying development and diseases of axon fascicles.

This protocol provides a comprehensive procedure to fabricate human iPS cell-derived motor nerve organoid through spontaneous assembly of a robust bundle of axons extended from a spheroid in a tissue culture chip.

ثلاثي الأبعاد موتور العصب الجهازية جيل

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.

تصوير ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع من المنظمة الخلوية في اللحاء الجديد الماوس

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video