يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في علم الأعصاب، مثل قطبية الخلايا العصبية الحركية، والتوجيه المحوري، والاتجار بمحور عصبي، وآليات التنكس العصبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو الحصول على ثقافة الخلايا العصبية الحركية المخصب للغاية في حين أننا نأخذ للتعبير عن البروتين لدينا ضربة قاضية من قبل المودة دقيقة. لبدء هذا الإجراء، ضع جنينًا واحدًا في طبق من وسائل التشريح المرمزة بالسيليكون.
تحت المجهر، عقد الجنين مع البطن ضد السيليكون مع ملقط. مع الزوج الثاني من ملقط، أدخل واحدة من النصائح في القناة المركزية للنخاع الشوكي. ثم، إغلاق ملقط لتمزيق الأنسجة الظهرية قليلا.
كرر هذه العملية نحو الجانب كونيل حتى يتم فتح الحبل الشوكي بأكمله. بعد ذلك، ضع الجنين بحيث يكون الحبل الشوكي المفتوح ضد السيليكون. في وقت لاحق، فصل الجزء من العمود الفقري من الجسم.
قرصة الجزء من الحبل الشوكي، وسحب الجنين من الرأس لاستخراج الحبل الشوكي. سحب بعناية بعيدا أي السحايا المتبقية وDDGs لا تزال تعلق على الحبل الشوكي. قم بتسطيح الحبل الشوكي على السيليكون واستخدام مشرط، وإزالة نصف الظهر من الحبل بقطع على طول منتصف كل جانب.
قطع الجزء الأوسط إلى عشر قطع، ونقلها إلى أنبوب جديد. لإعداد تعليق خلايا النخاع الشوكي، قم بجمع قطع الحبل الشوكي في الجزء السفلي من الأنبوب. استبدال HBSS مع ملليلتر واحد من لحم الخنزير F-10 المتوسطة وإضافة عشرة ميكرولترات من التربسين.
احتضان الأنبوب لمدة عشر دقائق في 37 درجة مئوية. لوقف الهضم الأنزيمي، نقل الشظايا إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر، تحتوي على 800 ميكرولتر من كامل L-15 المتوسطة، 100 ميكرولترات من 4٪ BSA، و 100 ميكرولترات من DNAs و titrate، مرتين. دع الشظايا تستقر لمدة دقيقتين قبل جمع المابير في أنبوب 15 ملليلتر جديد.
أضف برفق مليلترين من 4٪ BSA في الجزء السفلي من الأنبوب الفائق. سينترو يصهرها عند 470 x جاذبية لمدة 5 دقائق. بعد 5 دقائق، وإزالة عظمى وإعادة تعليق البليت الخلية مع 2 ملليلتر من متوسطة L-15 كاملة.
لإثراء موتونيورون، تقسيم تعليق الخلية إلى اثنين من أنابيب 15 ملليلتر. ثم، إضافة ملليلتر اثنين من L-15 PH المتوسطة لكل أنبوب. إذا بدأت بستة أجنة، استخدم ما يعادل ثلاثة أجنة لكل أنبوب، وثلاثة ملليلترات متوسطة.
إضافة ببطء 2 ملليلتر من حل الكثافة gradience، إلى الجزء السفلي من كل أنبوب للحصول على واجهة حادة. بعد ذلك، سينترو الصمامات في 830 × الجاذبية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد هذه الخطوة، يجب أن تكون الخلايا الصغيرة في الجزء السفلي من الأنبوب، في حين أن الخلايا الكبيرة مثل motoneuron- ينبغي أن تكون في حل التدرج الكثافة/ واجهة متوسطة.
Asperae 1 إلى 2 ملليلتر من الخلايا في واجهة ونقلها إلى أنبوب 15 ملليلتر الطازجة. ضبط مستوى الصوت إلى عشرة ملليلترات مع L-15 PH المتوسطة. في وقت لاحق، إضافة ملليلتر اثنين من وسادة BSA 4٪ إلى الجزء السفلي من الأنابيب اثنين.
ويندمج سنترو عند 470 × الجاذبية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد 5 دقائق، وإزالة عظمى وإعادة تعليق البليت و 3 ملليلتر من متوسطة L-15 كاملة. كرر الذبذبة المركزية عند 470 × الجاذبية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ثم، إزالة الفائقة وإعادة تعليق البليت الخلية ومليلتر اثنين من ثقافة كاملة المتوسطة. لثقافة الخلايا العصبية الحركية، تمييع لهم إلى 5، 000-10، 000 الخلايا في 500 ميكرولترات من الثقافة المتوسطة في بئر في لوحة 24 جيدا. ثم، إزالة حل laminae مع في P-1، 000 تلميح pipet.
نقل الخلايا العصبية الحركية على الفور المخفف في وسط الثقافة. إلى لوحات الترميز لتجنب التجفيف. لإعداد الحمض النووي، إعادة تعليق 1 ميكروغرام من الحمض النووي في 50 ميكرولترات من متوسطة الثقافة العصبية.
ودوامة لمدة 5 ثوان. لإعداد أنبوب B، إعادة تعليق 1.5 ميكرولترات من الخرز في 50 ميكرولترات من متوسطة ثقافة الخلايا العصبية. أضف 50 ميكرولترات من محلول الخرز إلى 50 ميكرولترات من محلول الحمض النووي وحضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
خلال هذا الحضانة، سحب 100 ميكرولترات من الوسط الثقافة من البئر التي سيتم نقل العدوى. في وقت لاحق، نقل 100 ميكرولترات من مزيج حبة الحمض النووي إلى كل بئر. واحتضان لوحة 24 جيدا، 20-30 دقيقة على لوحة المغناطيسي في 37 درجة مئوية.
هو مبين هنا، هو مورفولوجيا الخلايا العصبية المودم كشفت عن طريق الوقوف من سلسلة العصبية غير الفوسفورية غير ذاتية الثقيلة بعد أربعة أيام من الثقافة. في هذه الصور، وتظهر مورفولوجيا الخلايا العصبية المودم بعد أربعة أيام في المختبر وtransfected للجينة عبر EGFP عن طريق المغنطيسة في اليوم الثاني. وكانت الخلايا العصبية شعار مضادة ملطخة مع علامة SMI-32 أو علامة عموم العصبية TUJ-1 والسهام تشير إلى سوما من الخلايا العصبية.
هذه هي صورها confocal من الخلايا العصبية الحركية المصابة المغنطيسية، والتعبير عن نوع البرية أو متحولة EGFP NEFH ثوابت وملطخة لعلامة autophagic LC-3B. الأسهم تظهر مجاميع البروتين EGFP NEFH متحولة التي هي أيضا LC-3B إيجابية بعد هذا الإجراء، montoholda curcha يمكن تحليلها عن طريق المجهر الفيديو لتصور الاتجار بمحور المحاور وإضافة بعض التوجيهات. بعد تطورها الأولي لمعالجة الأسئلة الأساسية في علم الأحياء العصبية ، تثبت هذه التقنية أيضًا أنها أداة قوية لاستكشاف الآليات المرضية الفيزيوية التي تورط طيف اضطرابات ال موتونيورون ، مثل مرض متلازمة الصدمة السامة ، التصلب الجانبي السام ، أو ضمور العضلات الشوكي.
