هذه الطريقة البسيطة نسبيا يمكن أن تساعد البحوث التي تركز على الخلايا العصبية الحركية والتقاطعات العصبية والعضلية في الصحة والمرض. يستخدم هذا البروتوكول تكنولوجيا الخلايا الجذعية القياسية والأجهزة الدقيقة المتاحة تجاريا مما يزيد من إمكانية إعادة الإنتاج. قطع الخلايا العصبية الحركية وخلايا العضلات هو ظاهرة مبكرة في العديد من الأمراض العصبية والعضلية.
ويمكن لنموذج إنساني بسيط أن يساعد على وضع استراتيجيات لمواجهة هذه الظاهرة. نحن نستخدم هذا النموذج للتحقيق في اضطراب الخلايا العصبية الحركية, التصلب الجانبي الضموري, ومع ذلك, ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النموذج لاضطرابات أخرى في وحدة المحرك الذي ضروري. ابدأ بنقل الجهاز باستخدام ملقط من حاوية الشحن إلى طبق بيتري الذي يحتوي على 10 ملليلترات من 70٪ إلى 100٪ إيثانول للتعقيم لمدة 10 ثوان.
نقل الجهاز مع ملقط إلى قطعة من الورق لتجف الهواء في تدفق لامينار لمدة 30 دقيقة تقريبا. بمجرد تجفيف الجهاز ، استخدم ملقط لنقل كل جهاز إلى طبق بيتري فردي طوله 10 سنتيمترات. لتغليف الجهاز مع Poly-L-ornithine أو PLO، أضف 100 ميكرولتر من محلول PLO إلى البئر العلوي ولاحظ مرور السائل من الأعلى جيدا عبر القناة إلى البئر السفلي.
ثم، إضافة 100 ميكرولتر من حل منظمة التحرير الفلسطينية إلى البئر السفلي، وكرر على الجانب الآخر من الأخافير الصغيرة. الانتهاء من خلال إضافة 100 ميكرولتر من حل منظمة التحرير الفلسطينية على جانب واحد لخلق تدرج حجم بين الجانبين معكوسة من الجهاز لمعطف الأخافير الصغيرة. احتضان لمدة ثلاث ساعات في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد ثلاث ساعات، اغسل الجهاز ثلاث مرات لمدة خمس دقائق باستخدام DPBS. معطف الجهاز مع 20 ميكروغرام لكل صفح ملليلتر والمتوسطة العصبية عن طريق اتباع الإجراء مماثلة لطلاء منظمة التحرير الفلسطينية. احتضان الجهاز بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في اليوم التالي استخدام ماصة 200 ميكرولتر ووضع طرف في المقابل تماما لفتح القناة لإزالة طلاء صفح من الآبار. بعد إضافة DPBS إلى جميع الآبار ، اترك الأجهزة مع DPBS في تدفق Laminar في درجة حرارة الغرفة لزرع الخلايا. قطع الأوراق SCM إلى حجم الجهاز في حين ترك بضعة ملليمترات على كل جانب.
بعد تعقيم الأجهزة وأوراق SCM في طبق بيتري يحتوي على 10 ملليلتر من 70٪ إلى 100٪ الإيثانول لمدة 10 ثوان، نقل الأجهزة مع ملقط إلى لوحة من ستة آبار وصحائف SCM إلى طبق بيتري 10 سم لتجفيف الهواء في تدفق اللامينار. ضع الجهاز على حافة الحافة للسماح لجميع الجوانب بالجفاف لمدة 30 دقيقة تقريبا. معطف الأجهزة عن طريق إضافة ملليلتر واحد من حل منظمة التحرير الفلسطينية لكل بئر لكل جهاز في لوحة من ستة آبار.
تأكد من أن الجهاز يطفو فوق حل منظمة التحرير الفلسطينية مع القناة والجانب الأخدود الصغير الذي يواجه السائل. قم بتغليف أوراق SCM بإضافة 10 ملليلتر من محلول PLO إلى طبق بيتري الذي يبلغ طوله 10 سنتيمترات ، واستخدم ملقط لدفع أوراق SCM إلى السائل. احتضان الأجهزة وأوراق SCM لمدة ثلاث ساعات كما هو موضح سابقا.
بعد ثلاث ساعات، اغسل الأجهزة وأوراق SCM مرتين لمدة خمس دقائق مع DPBS تليها غسل آخر لمدة خمس دقائق بالماء العقيم. ثم نقل كل ورقة SCM إلى طبق بيتري 10 سم الفردية للهواء الجاف. أثناء العمل تحت المجهر في تدفق Laminar ، استخدم ملقط لتركيب جهاز السيليكون مع القناة والجانب الأخدود الصغير لأسفل بزاوية 90 درجة على ورقة SCM لضمان محاذاة جميع الجوانب.
اضغط بخفة على الجهاز للتأكد من ختم ليس فقط الحواف الخارجية، ولكن أيضا حول الآبار والقنوات والأخاد الصغيرة. لمعطف الجهاز مع صفح، داخل تدفق لامينار وتحت المجهر، إضافة 100 ميكرولتر من 20 ميكروغرام لكل محلول ملليلتر من اللامينين في البئر العلوي باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. مراقبة السائل يمر من أعلى جيدا من خلال القناة إلى أسفل البئر دون أي تسرب حول البئر والقناة.
في وقت لاحق، إضافة 100 ميكرولتر من محلول صفح إلى أسفل جيدا، كرر على الجانب الآخر من الأخافير الصغيرة والانتهاء مع 100 ميكرولتر إضافية من صفح على جانب واحد لخلق تدرج حجم بين الجانبين معكوسة من الجهاز لمعطف الأخافير الصغيرة، ثم احتضان الجهاز بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، قم بإزالة الطلاء من الآبار مع ماصة 200 ميكرولتر عن طريق وضع الطرف في الجزء المقابل لفتح القناة، بعد إضافة DPBS إلى جميع الآبار، اترك الأجهزة مع DPBS في تدفق لامينار في درجة حرارة الغرفة لزرع الخلايا. للوحة خلايا السلف العصبية أو الشخصيات في الجهاز microfluidic، وإزالة DPBS من بئرين على جانب واحد من الأخافير الصغيرة في الجهاز باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
لزرع ما مجموعه 250، 000 NPCs و 60 إلى 100 ميكرولتر من اليوم 10 الخلايا العصبية الحركية المتوسطة لكل جهاز، في أعلى البئر الأيمن، نصف البذور من تعليق الخلية على مقربة من فتح القناة بزاوية 45 درجة. توقف لبضع ثوان للسماح لتعليق الخلية بالتدفق عبر القناة قبل إضافة النصف المتبقي من تعليق الخلية في البئر السفلي. استخدم قلما لوضع علامة على الجانب المصنف على أنه NPC أو ما يعادله ، لتسهيل توجيه الجهاز بدون مجهر ، واحتضانه لمدة خمس دقائق لمرفق الخلية.
المقبل، أعلى ببطء حتى اثنين من الآبار NPC المصنف مع يوم إضافي 10 الخلايا العصبية الحركية المتوسطة إلى حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر لكل بئر. باستخدام ماصة 200 ميكرولتر، قم بإزالة DPBS من البئرين على الجانب الآخر من الأخافير الصغيرة المقابلة ل NPCs المصنفة حديثا.
ثم أضف ستة ملليلترات من DPBS لكل طبق طوله 10 سنتيمترات حول الجهاز لمنع تبخر الوسط أثناء الحضانة. لتغيير الوسط، قم بإزالة الوسائط ببطء في كلا البئرين باستخدام NPCs عن طريق وضع طرف ماصة 200 ميكرولتر في الحافة السفلية لجدار البئر المقابل لفتح القناة. لمنع تدفق متوسط قوي من إتلاف الخلايا على القناة، إضافة ببطء 50 إلى 100 ميكرولتر من الخلايا العصبية الحركية الطازجة المتوسطة إلى كل بئر عن طريق تغيير مستمر بين أعلى وأسفل جيدا.
كرر العملية حتى يحتوي كل بئر على 200 ميكرولتر من المتوسط. في اليوم 17 من التمايز العصبي الحركي، وإزالة متوسط الخلايا العصبية الحركية على الجانب غير المصنف من الأخافير الصغيرة في الجهاز مع ماصة 200 ميكرولتر وغسل الآبار مع DPBS. البذور ما مجموعه 200،000 mesoangioblasts الأولية البشرية أو MABs، في 60 إلى 100 ميكرولتر من متوسط النمو لكل جهاز عن طريق بذر نصف تعليق الخلية في البئر العلوي.
وقفة لبضع ثوان للسماح لتعليق الخلية لتدفق من خلال القناة قبل بذر النصف المتبقي من تعليق الخلية في البئر السفلي، كما هو موضح في وقت سابق للطلاء NPCs. احتضان الجهاز لمدة خمس دقائق لمرفق الخلية. ثم أعلى اثنين من الآبار الطازجة MAB المصنف مع متوسط نمو إضافية واحتضان مرة أخرى كما هو موضح.
لبدء تكتيك العلاج الكيميائي والتدرج الحجمي في اليوم الحادي والعشرين من تمايز الخلايا العصبية الحركية ، أضف 200 ميكرولتر لكل بئر من الوسط العصبي العصبي الحركي الذي يحتوي على عوامل النمو إلى مقصورة Myotube ، ثم أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من المتوسط القاعدي للخلايا العصبية الحركية دون عوامل نمو إلى مقصورة الخلايا العصبية الحركية. من المهم تقييم إمكانات التفريق لخطوط الخلية قبل المشاركة في زراعة هذه الخطوط في أجهزة ميكروفلويديك. تم تحديد مؤشر الاندماج ل MABs ، وقدر أن حوالي 8٪ كافية للثقافة المشتركة.
وكانت الثقافات الخلايا العصبية الحركية ولدت 85 إلى 95٪ إيجابية لعلامات الخلايا العصبية الحركية. لوصف وتحديد كمية التقاطعات العصبية والعضلية أو NMJs ، تم حساب عدد التوطينات المشتركة بين الخلايا العصبية الحركية وعلامات ما قبل المتشابكة العصبية السلسلة الثقيلة والسيبتوفيسين وعلامة مستقبلات الأسيتلين ما بعد المتشابك ألفا bungarotoxin ، من خلال كل كومة مرض وتم تطبيعها في عدد من سلسلة الميوزين الثقيلة المسماة Myotubes الموجودة في Z-stack. ظهرت NMJs كنقطة اتصال واحدة NMJs حيث تطرق neurite على مجموعة من مستقبلات الكولين خفية في نقطة تفاعل واحدة.
أو كنقطة اتصال متعددة NMJs حيث انتشر neurite واشتبك مع مجموعة مستقبلات الكولين خفية على سطح أكبر. القياس الكمي للنسبة المئوية للخلايا العصبية الحركية ابتكر Myotubes أشار إلى أن ليس كل Myotubes الواردة NMJs. عند تنشيط الخلايا العصبية الحركية مع كلوريد البوتاسيوم ، لوحظ تدفق الكالسيوم في Fluo-4 المسمى Myotubes ، والذي أكد وجود اتصال وظيفي من خلال نيوريت الخلايا العصبية الحركية في Myotube ، بالإضافة إلى مانع NMJ d-tubocurarine ، أو DTC إلى مقصورة Myotube أدى إلى تثبيط تدفق الكالسيوم.
أن يكون أكبر نجاح مع هذا النموذج من المهم بشكل لا يصدق لأداء فحص جودة خط الخلية وتجنب تشكيل فقاعات الهواء في قنوات الجهاز. الجمع بين تقاطع العصبية والعضلية في طبق مع أنواع الخلايا المباشرة IPC أخرى تحاكي حتى أفضل الوضع في المختبر، وهذا يسمح أيضا لدراسة دور هذه الأنواع من الخلايا.
