Name: induction of hypoxia in living frog and zebrafish embryos
Uploaded: 2017-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل بدعم من جائزة ويلكوم ترست سيا 100329 / Z / 12 / Z إلى واه وزمالة دفغ خ 376 / 1-1 منحت لهونغ كونغ

<ol>
	<li>Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-altitude+physiology+and+pathophysiology:+implications+and+relevance+for+intensive+care+medicine.">High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine.</a> Crit Care. 11 (1), 203 (2007).</li><li>Grant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+level+and+acute+responses+to+hypoxia:+do+they+predict+physiological+responses+and+acute+mountain+sickness+at+altitude?.">Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude?.</a> Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).</li><li>Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor-binding+protein-1+(IGFBP-1)+mediates+hypoxia-induced+embryonic+growth+and+developmental+retardation.">Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation.</a> PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).</li><li>Ong, K. K., Dunger, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+growth+failure:+the+road+to+obesity,+insulin+resistance+and+cardiovascular+disease+in+adults.">Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults.</a> Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).</li><li>Maxwell, P., Salnikow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1:+an+oxygen+and+metal+responsive+transcription+factor.">HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor.</a> Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).</li><li>Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+genes+encoding+glycolytic+enzymes+by+hypoxia-inducible+factor+1.">Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1.</a> J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).</li><li>Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cobalt+inhibits+the+interaction+between+hypoxia-inducible+factor-alpha+and+von+Hippel-Lindau+protein+by+direct+binding+to+hypoxia-inducible+factor-alpha.">Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha.</a> J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).</li><li>Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+HIFs,+buts+and+maybes+of+hypoxia+signalling+in+disease:+lessons+from+zebrafish+models.">Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-mimetic+agents+desferrioxamine+and+cobalt+chloride+induce+leukemic+cell+apoptosis+through+different+hypoxia-inducible+factor-1alpha+independent+mechanisms.">Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms.</a> Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).</li><li>Woods, I. G., Imam, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+severe+hypoxic+stress+during+development+in+zebrafish.">Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish.</a> Genom Data. 6, 83-88 (2015).</li><li>Rouhi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+metastasis+model+in+embryonic+zebrafish.">Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish.</a> Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).</li><li>Stevenson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+disruption+of+vertebrate+CAN+pathfinding+through+EphrinB2+is+rescued+by+magnesium.">Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium.</a> PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).</li><li>Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient-Deprived+Retinal+Progenitors+Proliferate+in+Response+to+Hypoxia:+Interaction+of+the+HIF-1+and+mTOR+Pathway.">Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway.</a> J Dev Biol. 4 (2), (2016).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, D. P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).</li><li>McDonough, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+Culture,+and+Analysis+of+Xenopus+laevis+Embryonic+Retinal+Tissue.">Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue.</a> JoVE. (70), (2012).</li></ol>

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

هنا قدمنا ​​طريقة جديدة سهلة ولكنها قوية للحث على نقص الأكسجة التي يتم تعديلها للاستخدام مع الأجنة الضفدع والزرد ولكن يمكن أيضا أن تكون مناسبة للكائنات المائية الأخرى. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة تكمن في بساطته وكفاءته من حيث التكلفة. ومع ذلك، فإن النتائج التي ت?...

بحوث نقص الأكسجة لديها العديد من التطبيقات. وتشمل هذه التحقيق في التسبب وتطوير العلاجات للحالات الطبية التي تتميز نقص الأكسجة 1 والأمراض ارتفاع حاد حاد 2 . يسبب نقص الأكسجة تغيرات الأيض الرئيسية في جميع الكائنات الحية التي تتطلب الأوكسجين. الإجهاد نقص الأكسجين يؤثر أيضا على نمو الجنين والتنمية والتسبب في العديد من الأمراض البشرية، بما في ذلك تقييد النمو داخل الرحم 3 . لا يمكن أن يؤدي إجهاد نقص الأكسجة فقط إلى انخفاض وزن المواليد، أو وفيات الجنين أو حديثي الولادة، بل يمكن أن يؤدي أيضا إلى مضاعفات كثيرة في حياة البالغين، مثل أمراض القلب والأوعية الدموية وداء السكري من النوع 2 والبدانة وارتفاع ضغط الدم 4 . وغالبا ما يلاحظ الإجهاد نقص الأكسجة أثناء تطور الورم الصلبة، عندما الأنسجة الورم يتفوق إمدادات الدم لها. ولذلك فمن الأهمية بمكان أن تكون قادرة على دراسة آثار نقص الأكسجين في الجسم الحي ومباشرة خلال إمبر<html> التنمية اليونية. من بين الطرق الأكثر شهرة التي تم استخدامها لدراسة تأثير نقص الأكسجة أثناء التنمية هو استخدام كلوريد الكوبالت في وسط النمو أو حضانة الكائن الحي في غرفة نقص الأكسجين. كلوريد الكوبالت يحفز اصطناعيا استجابة نقص الأكسجة تحت تركيز الأكسجين العادي، نظرا لدورها في استقرار الأكسجين محفز عامل 1 ألفا (هيف-1α) عن طريق منع تدهور بروتيوسومي لها 5 ، 6 ، 7 . ومع ذلك، كونها طريقة مريحة 8 ، واستخدام كلوريد الكوبالت، فضلا عن غيرها من مماثلة كيميائيات نقص الأكسجة الكيميائية يمكن أن يكون لها تأثير ضار غير محدد على الخلايا والأنسجة، على سبيل المثال ، موت الخلايا المبرمج 9 . لذلك، غرف نقص الأكسجين هي طريقة أفضل لتحريض &quot;نقص الأكسجين الطبيعي&quot; في الكائنات الحية من خلال مسار التطور الطبيعي. نتنت &quot;&gt; لقد ركزنا على تطوير نظام لتحريض نقص الأكسجة في الأجنة الحيوانية المائية، وقد أصبحت كل من الضفادع والزرد الآن الكائنات نموذجية الفقاريات بالمعلومات لدراسات العديد من العمليات البيولوجية، وكذلك نماذج لمختلف الأمراض البشرية.الأجنة الضفدع والزرد وتطور من الخارج، مما يؤدي إلى القضاء على مضاعفات تعويض الأمهات.وعلاوة على ذلك، فإن مسار سريع للتنمية يجعل من الممكن التلاعب العوامل البيئية ومراقبة التغيرات المظهرية في تشكيل الجهاز في الوقت الحقيقي.بالإضافة إلى ذلك، يتم حفظ العديد من مكونات مسارات التنبيه إشارة رئيسية للغاية في وهذه الكائنات النموذجية وقد تميزت بالتفصيل من قبل مجموعة كبيرة من الأدب، والميزة الرئيسية في استخدام الضفادع والأجنة الزرد لدراسة آثار نقص الأكسجين على تطوير الفقاريات هو أن جميع العمليات يمكن رصدها مباشرة، منذ الأكسجين تخترق بسرعة الأجنة. وهكذا، في الضفادع والزرد، كما هو على النقيض من الكائنات نموذج آخر مثلالأجنة الماوس، وتأثير تركيز الأكسجين محددة يمكن دراستها في الأنسجة من الفائدة، دون الأخذ بعين الاعتبار وجود أو عدم وجود الأوعية الدموية وظيفية. معظم الإمدادات المتاحة تجاريا لحضانة الأكسجين غير مؤات من كونها كبيرة نسبيا ولها ارتفاع تكاليف التشغيل المقابلة. وبصرف النظر عن ارتفاع التكلفة الأولية واستهلاك الغاز، موازنة وصيانة غرف نقص الأكسجة المشتركة تتطلب الحفاظ على جو من نقص الأكسجين المستمر ضد التدرج الغاز التي تحدث بشكل طبيعي في هذه الغرف بسبب حجمها أكبر و / أو تنفس الكائن الحي. وهذا يتطلب توظيف مراوح الغاز ونظام التبريد، مما يزيد من كمية المعدات الإضافية اللازمة، ويعوق البراعة الباحث ويقلل عموما بساطة الإجراء التجريبي. في المقابل، فإن الإعداد الذي نقدمه هنا قوي نسبيا ولكن فعالة جدا من حيث التكلفة، صغيرة، وسهلة لإقامة ويسمح وأست توازن الغاز، جو ناقص الأكسجين مستقرة وتبادل بسيط من المواد والحلول داخل الغرفة. نظامنا يمكن استخدامها للاستخدام مع أي كائن نموذج المائية من الفائدة. لقد شيدت غرفة نقص الأكسجة التي هي صغيرة مريحة، وبالتالي يمكن وضعها داخل حاضنة المختبر المشتركة، والتي تسمح بسهولة الإجراءات التجريبية في أي درجة حرارة محددة. توفير السيطرة مريحة من درجة الحرارة وكذلك تركيز الأكسجين في المتوسط، وميزة نظامنا ضد حاضنات نقص الأكسجة المتاحة تجاريا تكمن في صغر حجمها وكفاءة التكلفة. وبالتالي، يمكن إنشاء الإعداد لدينا باستخدام إمدادات المختبرات العامة المتاحة لمعظم مختبرات البحوث ولا تتطلب أي مواد باهظة الثمن. وبالإضافة إلى ذلك، لدينا الإعداد لا تولد الحرارة، على عكس حاضنات نقص الأكسجة المتاحة تجاريا، ويسمح للاستخدام في درجات حرارة أقل من درجة حرارة الغرفة التي توضع في حاضنة. ذي لاست أهمية خاصة للعمل مع الكائنات الحية ذات الدم البارد مثل الضفادع والأسماك حيث تعتمد معدلات النمو والتمثيل الغذائي بقوة على درجة الحرارة. وبفضل فعاليتها من حيث التكلفة وبسهولة، فإن غرفة حضانة الغاز لدينا تنوعا جدا في تحديد ظروف مختلفة من نقص الأوكسجين أو فرط التأكسج، فضلا عن تمكين الإدارة السريعة والسهلة لوسائل الإعلام والحلول المختلفة لعدد كبير من الظروف التجريبية. وبالإضافة إلى ذلك، توظيف لوحة 24 جيدا بدلا من الأطباق المستخدمة عادة أو الدبابات المختبرية 10 ، 11 ، 12 ، ونظامنا يسمح المراقبة والعلاج التجريبي لعدة شروط متحولة في آن واحد. للسيطرة على تحريض الصحيح من نقص الأكسجة، لقد رصدنا مستويات البروتين هيف-1α بواسطة الكشف لطخة غربية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عدد الخلايا التكاثر قبل وبعد إنكوباتيون في غرفة نقص الأكسجين يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان نقص الأكسجة قد تسبب في الأنسجة. ويستند هذا الأسلوب على نتائجنا المنشورة سابقا 13 ، والتي تبين أن انتشار في الشبكية الجذعية شبكية الخلايا الجذعية يقلل على تحريض نقص الأكسجين. وهكذا، فقد رصدنا مستوى تكاثر الخلايا الجذعية الشبكية عن طريق إضافة 5-إثينيل-2&#39;-ديوكسيوريدين (إيدو) إلى المتوسطة الجنين وقياس دمجها في الحمض النووي للخلايا تكاثر حديثا.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>KCl/0.1x MBS, Embryo mediu,</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;/0.1x MBS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>0.1x MBS</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/0.1x MBS, Embryo medium</td></tr><tr><td>Calcium nitrate</td><td>Sigma</td><td>202967</td><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/0.1x MBS</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/0.1x MBS, Embryo medium</td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td>Embryo medium</td></tr><tr><td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>CG10</td><td>Frog fertilization</td></tr><tr><td>Zebrafish breeding tank</td><td>Carolina</td><td>161937</td><td>Gas chamber construction</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction</td></tr><tr><td>Epoxy resin</td><td>RS Components UK</td><td>Kit 199-1468</td><td></td></tr><tr><td>Gas distributor valve</td><td>WPI Luer Valves</td><td>Kit 14011</td><td>Aquatic tank attachment (Schema 1, &lt;strong&gt;H&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>High precision gas valve</td><td>BOC&amp;nbsp;</td><td>200 bar HiQ C106X/2B</td><td>Gas tank attachment (Schema 1, &lt;strong&gt;I&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>5% oxygen and 95% N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>BOC</td><td>226686-L</td><td>Hypoxic gas mixture</td></tr><tr><td>ceramic disc diffuser</td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Art&amp;nbsp;</td><td>Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005</td><td>Schema 1, &lt;strong&gt;J&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>silicone grease</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>VAC1100</td><td>Schema 1, &lt;strong&gt;K&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>oxymeter</td><td>Oxford Optronix&amp;nbsp;</td><td>Oxylite, CP/022/001</td><td>Hypoxic chamber setup</td></tr><tr><td>fibre-optic dissolved oxygen sensor</td><td>Oxford Optronix</td><td>HL_BF/OT/E</td><td>Hypoxic chamber setup</td></tr><tr><td>plastic pasteur pipette</td><td>Sterilin</td><td>STS3855604D</td><td>For embryo transfer</td></tr><tr><td>MS222&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td>Embryo anesthetic</td></tr><tr><td>RIPA buffer&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R0278-50ML</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>Protease inhibitor</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>4x Laemmli loading buffer, 10x TBST</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer</td></tr><tr><td>beta-Mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Trizma base&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>5x Running buffer, Transfer buffer</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>5x Running buffer, Transfer buffer</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>Transfer buffer</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ML</td><td>10x TBST</td></tr><tr><td>skim milk powder</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td>Blocking Solution</td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge tube</td><td>Sigma</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>tissue homogenizer</td><td>Pellet Pestle Motor Kontes</td><td>Z359971</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>pellet pestles</td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>precast 12% gel</td><td>Biorad</td><td>Mini-ProteinTGX, 456-1043</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>protein ladder</td><td>Amersham</td><td>Full-Range Rainbow ladder, RPN800E</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>nitrocellulose membrane (0.45 &amp;micro;m)</td><td>Biorad</td><td>162-0115</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anti-HIF-1&amp;alpha; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab2185</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anti-&amp;alpha;-tubulin antibody</td><td>Sigma</td><td>T6074</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>goat anti-rabbit antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>goat anti-mouse antibody</td><td>Abcam</td><td>ab97080</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Pierce ECL 2 reagent&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>80196</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>ECL films Hyperfilm</td><td>GE Healthcare Amersham</td><td>28906837</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>5-Ethynyl-2&amp;prime;-deoxyuridine &amp;nbsp;</td><td>santa cruz</td><td>CAS&amp;nbsp;61135-33-9</td><td>EdU, EdU incorporation</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>1x</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>Fixation solution</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fluka</td><td>S/8600/60</td><td>Solution solution</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>PBST</td></tr><tr><td>Heat-inactivated Goat Serum (HiGS)</td><td>Sigma</td><td>G6767-100ml</td><td>Blocking solution (EdU incorporation)</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI, EdU incorporation</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Molecular Probes</td><td>C10338</td><td>EdU incorporation</td></tr><tr><td>glass vial</td><td>VWR</td><td>98178853</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>Tissue-Plus optimal cutting temperature compound&amp;nbsp;</td><td>Scigen</td><td>4563</td><td>Embedding medium, EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>cryostat Jung Fridgocut 2800E</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3035S</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>microscope slides Super-Frost plus Menzel glass</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>EdU Click-iT chemistry kit</td><td>Molecular Probes</td><td>C10338</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>FluorSave</td><td>Calbiochem</td><td>D00170200</td><td>Mounting medium, EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>coverslips</td><td>VWR</td><td>ECN631-1575</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>confocal scanning microscope</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>Volocity software</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr></tbody></table>

induction of hypoxia in living frog and zebrafish embryos

هنا، نحن نقدم نظاما جديدا لتحريض نقص الأكسجين، الذي وضعنا لدراسة آثار نقص الأكسجين في الكائنات المائية مثل الأجنة الضفدع والزرد. يتكون نظامنا من غرفة تتميز بإعداد بسيط مع ذلك قوي للحث والحفاظ على تركيز الأكسجين ودرجة الحرارة المحددة في أي حل تجريبي من الاختيار. النظام المقدم هو جدا فعالة من حيث التكلفة ولكن وظيفية للغاية، فإنه يسمح الاستقراء والحفاظ على نقص الأكسجة للتجارب المباشرة في الجسم الحي وللفترات الزمنية المختلفة تصل إلى 48 ساعة. لمراقبة ودراسة آثار نقص الأكسجة، استخدمنا طريقتين - قياس مستويات عامل نقص الأكسجين المحفز 1 ألفا (هيف-1α) في الأجنة كاملة أو الأنسجة المحددة وتحديد تكاثر الخلايا الجذعية الشبكية بنسبة 5-إثينيل-2&#39;- ديوكسيوريدين (إيدو) دمج في الحمض النووي. مستويات هيف-1α يمكن أن تكون بمثابة علامة نقص الأكسجين العام في الجنين كله أو الأنسجةمن الاختيار، هنا شبكية العين الجنينية. دمج إيدو في الخلايا المتكاثر من شبكية العين الجنينية هو ناتج معين من تحريض نقص الأكسجة. وهكذا، فقد أظهرنا أن أسلاف الشبكية الجنينية نقص الأكسجة انخفاض الانتشار في غضون ساعة واحدة من الحضانة تحت 5٪ من الأكسجين من كل من الأجنة الضفدع والزرد. مرة واحدة يتقن، يمكن أن تستخدم لدينا الإعداد للاستخدام مع الكائنات الحية المائية الصغيرة، لتجارب مباشرة في الجسم الحي ، أي فترة زمنية معينة وتحت العادي، نقص الأكسجة أو تركيز الأكسجين مفرط الأكسجين أو تحت أي خليط الغاز معين آخر.

توظيف نظام غرفة نقص الأكسجة التي نقدمها هنا يسمح لدراسة آثار نقص الأكسجين بشكل فردي وفي الجسم الحي في الحيوانات الحية كلها. نقص الأكسجين يمكن أن يتسبب عن طريق وضع الأجنة الضفدع أو الزرد كامل في غرفة نقص الأكسجين ( الشكل 1 )، ويتم ?...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos at JoVE.com

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

نحن نقدم نظام غرفة هايبوكسيك الرواية للاستخدام مع الكائنات المائية مثل الضفدع والأجنة الزرد. نظامنا هو بسيط، قوي، فعالة من حيث التكلفة ويسمح للاستقراء والحفاظ على نقص الأكسجة في الجسم الحي ، وتصل إلى 48 ساعة. نقدم 2 أساليب قابلة لإعادة الإنتاج لمراقبة فعالية نقص الأكسجين.

تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

induction-of-hypoxia-in-living-frog-and-zebrafish-embryos

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K Views.  University of Cambridge.  نحن نقدم نظام غرفة هايبوكسيك الرواية للاستخدام مع الكائنات المائية مثل الضفدع والأجنة الزرد. نظامنا هو بسيط، قوي، فعالة من حيث التكلفة ويسمح للاستقراء والحفاظ على نقص الأكسجة في الجسم الحي ، وتصل إلى 48 ساعة. نقدم 2 أساليب قابلة لإعادة ...

Video: Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead زرع الأجنة الزرد

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

تصور الدماغ النامية في سمك الحمار الوحشي المعيشة باستخدام Brainbow والوقت الفاصل Confocal التصوير

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ثنائي الفوتون المستندة إلى تنشيط ضوئي في الأجنة الحية اسماك الزرد

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Biology

التحقيق في التطور مع التلاعب بالإشارات البصرية الجينية في الزرد

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

تسليط الضوء على المؤلف: التلاعب بالإشارات في أجنة الزرد لفك تشفير قرارات مصير الخلية 

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

تنشيط الإشارات البصرية الوراثية في أجنة الزرد

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

يعيش التصوير من النتوء خلية من البشرة من اسماك الزرد النامية

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

أثار الإجهاد خلية والموت عن طريق التقليدية للأشعة فوق البنفسجية ليزر متحد البؤر المجهر

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Neuroscience

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

الأيض تحليل الملف من الأجنة الزرد

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

التصوير والإعمار 3D من الهياكل الدماغية في الجنينية اسماك الزرد

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Microbead زرع الأجنة الزرد

تصور الدماغ النامية في سمك الحمار الوحشي المعيشة باستخدام Brainbow والوقت الفاصل Confocal التصوير

ثنائي الفوتون المستندة إلى تنشيط ضوئي في الأجنة الحية اسماك الزرد

تنشيط الإشارات البصرية الوراثية في أجنة الزرد

تنشيط الإشارات البصرية الوراثية في أجنة الزرد

تنشيط الإشارات البصرية الوراثية في أجنة الزرد

يعيش التصوير من النتوء خلية من البشرة من اسماك الزرد النامية

أثار الإجهاد خلية والموت عن طريق التقليدية للأشعة فوق البنفسجية ليزر متحد البؤر المجهر

الأيض تحليل الملف من الأجنة الزرد

التصوير والإعمار 3D من الهياكل الدماغية في الجنينية اسماك الزرد