Name: in vivo sirna transfection and gene knockdown in spinal cord via rapid noninvasive lumbar intrathecal injections in mice
Uploaded: 2014-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice at JoVE.com

وكانت جميع الإجراءات استخدام الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية التي وضعتها هيئة الإدارة المحلية (Regierungspräsidium كارلسروه، كارلسروه، ألمانيا). 1. إعداد مجمع سيرنا / جزيرة الأمير إدوارد يتم إعداد الحل سيرنا / PEI معقدة باستخدام توجيهات المصنع على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل ج: تمييع المبلغ المطلوب من سيرنا مع الماء المعقم (إذا لزم الأمر) ما يصل الى ربع حجم نهاية وتمييع هذا أيضا مع 10٪ محلول الجلوكوز تصل إلى نصف حجم النهاية. دوامة بلطف أو مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. كمية الأمثل للسيرنا يحتاج إلى أن تحدد تجريبيا ولكن 1 ميكروغرام سيرنا في 10 ميكرولتر حل معقد للحيوان الواحد هو نقطة انطلاق جيدة لتعظيم الاستفادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل ب: تمييع حجم الحاجة من PEI كاشف مع الماء المعقم تصل إلى ربع حجم نهاية وتمييع هذا أيضا مع 10٪ محلول الجلوكوز تصل إلى نصف حجم النهاية. دوامة جنرال الكتريكntly أو مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. ملاحظة: كمية PEI كاشف يحدد التوازن الأيوني في المجمع الذي يؤثر على كفاءة ترنسفكأيشن. كذلك كمية الأمثل للحل PEI لابد من تحديد تجريبيا. في أيدينا، فإن المبلغ الأمثل هو 0.12 ميكرولتر من PEI الحل لكل 1 ميكروغرام سيرنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الحل A B مع الحل في كل مرة، دوامة بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الحل مختلطة لمدة 15 دقيقة في RT قبل الاستخدام. هذا المجمع هو مستقر لمدة 2 ساعة على RT ولمدة 24 ساعة في 4 درجات مئوية. </li></ol> 2. حقن داخل القراب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفأر مع 3٪ isoflurane و، حتى لا يظهر أي علامات على المقوم منعكس. بالإضافة إلى ذلك، تحقق من وجود الذيل و / أو قرصة مخلب العاكسة لضمان مزيد من حالة التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحلق حوالي 2 سم 2 من الفراء في نهاية الخلفي من الحيوان بالقرب من قاعدة الذيل لتسهيل التصور أفضل أثناء غرز الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الماوس فيمخروط الأنف لإدارة isoflurane واستمرت أثناء الإجراء، والحد من isoflurane وإلى 1.5٪، وتغطية عيون الماوس مع زيوت التشحيم العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جاهزة للاستخدام سيرنا حل مختلطة باستخدام حقنة هاميلتون 25 ميكرولتر تعلق على 30 G 0.5 في الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع العملية الشائكة من L6، والتي ينبغي أن تكون واحدة من أبرز وإصلاح العمود الفقاريات حول هذه المنطقة عن طريق الضغط عليه برفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج بعناية الإبرة بين أخدود من L5 L6 وفقرات ومراعاة لنفض الغبار الذيل كما يشير هذا التوقيع إدخال الناجح للإبرة في الفضاء داخل الجافية. تلميح: استخدام ظفر، ينبغي للمرء أن يكون قادرا على تحديد موقع الأخدود أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة ويلاحظ الذيل نفض الغبار، وعلى الفور، ولكن بعناية، وتأمين موقف إبرة بيد واحدة وحقن حجم المطلوب من مادة مع جهة أخرى ببطء. نصيحة: حجم بين 5-10 ميكرولتر هو الأمثل حيث حجم أقل من 5 و# 181؛ ل لا يمكن الاعتماد عليها، وبحجم أكبر من 10 ميكرولتر يؤدي إلى الكثير من الضغوط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تنفيذ الحقن، وتحريك الماوس مرة أخرى إلى قفص للتعافي من التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار هذه الحقن لا يقل عن 2 مرات كل 24 ساعة لتحقيق downregulation المثلى من الجينات المستهدفة. </li></ol>

<ol>
	<li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).</li><li>Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+tactile+allodynia+following+intrathecal+puncture+in+mouse:+contributions+of+Toll-like+receptor+signaling.">Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling.</a> Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).</li><li>Goula, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+intravenous+delivery+of+transgenes+to+mouse+lung.">Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung.</a> Gene Ther. , 1291-1295 (1998).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).</li><li>Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+modulation+of+wide+dynamic+range+neurons+in+the+lumbar+dorsal+horn+of+the+rat+by+spinally+administered+WIN55,212-2.">Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2.</a> Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).</li><li>Song, Z. H., Takemori, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+spinal+kappa+opioid+receptors+in+the+antinociception+produced+by+intrathecally+administered+corticotropin-releasing+factor+in+mice.">Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).</li><li>Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+cannabinoid+(CB1)-receptors+in+the+development+and+maintenance+of+opioid+tolerance.">Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance.</a> Neuroscience. , 1275-1288 (2007).</li><li>Yaksh, T. L., Rudy, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+catheterization+of+the+spinal+subarachnoid+space.">Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space.</a> Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).</li><li>Tappe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+scaffolding+protein+Homer1a+protects+against+chronic+inflammatory+pain.">Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain.</a> Nat. Med. , 677-681 (2006).</li><li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+the+Cav3.2+T-type+calcium+channel+gene+in+sensory+neurons+demonstrates+its+major+role+in+nociception.">Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception.</a> EMBO J. 24, 315-324 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+dorsal+root+ganglia+by+intrathecal+injection:+effects+on+regeneration+of+peripheral+nerves.">Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves.</a> Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).</li><li>Wigdor, S., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+and+systemic+morphine-induced+antinociception+in+mice:+contribution+of+descending+serotonergic+and+noradrenergic+pathways.">Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).</li></ol>

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

وبالتالي، فإن تقنية المبين أعلاه حقن إبرة داخل القراب هو فعال وسريع، مترجمة على وجه التحديد، وغير تدميري. من الناحية الفنية، فإن الجانب الأكثر أهمية من هذا الإجراء هو نقطة الإدراج الإبرة في الأخدود. فمن الأهمية بمكان أن يتم هذا الإجراء مع أيدي هادئة جدا والصبر. مثل ا?...

الحبل الشوكي هو مركز مهم جدا في مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية الأساسية والوظائف الفسيولوجية، بما في ذلك تجهيز ونقل مؤلمة (مسبب للألم) المدخلات 4-7. وقد تم تطوير تقنيات تجريبية مختلفة لتسهيل التشكيل الدوائية من الحبل الشوكي، مثل زرع المزمنة القسطرة داخل القراب 8، حقن مكروي الحبل الشوكي، وحقن إبرة داخل القراب 9. كل تقنية مزاياه وعيوبه، واعتمادا على نموذج التجربة أسلوب واحد قد يكون أكثر ملاءمة من غيرها. في حين زرع المزمنة القسطرة داخل القراب هو ممكن بسهولة في الفئران، وهذه الطريقة من الصعب جدا في الماوس، ونظرا حجم القيود. نسبة نجاح منخفضة جدا والعجز الحركي وغالبا ما تحدث بسبب وجود ضخمة من قسطرة في الفضاء تحت الجافية تقتصر بشدة في الماوس. وعلاوة على ذلك، يتم تقديم التسليم على المدى الطويل من الأدوية بسبب تخثر المتكررةمن مزروع مزمنة القسطرة. أخيرا، وردود الفعل المناعي شائعة. يمكن التحايل هذه المشاكل باستخدام طريقة الحقن داخل القراب الحادة عن طريق إبرة في غياب قسطرة preimplanted، والتي تمكن التطبيق السريع وتشريحيا محدودة من الأدوية والكواشف إلى النخاع الشوكي لدى الفئران. هذا الأسلوب يحتفظ بالكامل فوائد التسليم داخل القراب على طرق أخرى النظامية التسليم (على سبيل المثال عن طريق الفم، في الوريد، داخل الصفاق، الخ) مثل خصوصية التشكيل الشوكي، والذي يسمح تخفيض الجرعات والآثار الجانبية الحد، وكذلك القدرة على تقديم المواد لا عادة لا عبور حاجز الدم في الدماغ منذ خلال حقن داخل القراب، يتم إدخال الإبرة بين الأم الجافية والحبل الشوكي. ولكن الأهم من ذلك، بالمقارنة مع غيرها من أساليب التسليم داخل القراب، وطريقة الحقن داخل القراب إبرة هو أقل الغازية، مما يتيح العديد من التطبيقات فينفس الحيوان دون أن تسبب أي تلف الأنسجة كبيرة أو إثارة رد فعل جهاز المناعة بسبب زرع المواد الأجنبية. ومع ذلك، فإنه يتطلب المهارات الفنية لاستهداف دقيقة جدا من الإبرة للسماح فعالية. هنا، علينا أن نظهر بصريا طريقة لتحقيق المعدل الأمثل لنجاح تستهدف على وجه التحديد الحبل الشوكي القطني. موقع الحقن الذي يتم اختياره في هذه التجربة هو الأخدود بين L5 L6 وعمود فقاري، وبالقرب من حيث ينتهي الحبل الشوكي، للتقليل من إمكانية الإضرار العمود الفقري. علاوة على ذلك، ونحن لشرح استخدام هذه التقنية لنهدم الجينات في النخاع الشوكي باستخدام الرناوات siRNAs.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt;-jetPEI</td><td>Polyplus</td><td>201-10G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>WAVE1 siRNA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-36832</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Control siRNA-A</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-37007</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-&amp;szlig;-Tubulin III antibody</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-WAVE1 antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF5514</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fast green dye</td><td>Sigma</td><td>F-7252</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurane setup</td><td>Dr&amp;auml;ger L&amp;uuml;beck</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Shaver</td><td>Wella</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hamilton syringe Gastight 1702</td><td>Hamilton</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>30 G 1/2 in 13 mm Needle</td><td>BD Microlance</td><td>304000</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Leica MS5</td><td>Leica</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>WAVE1 forward primer for qRT-PCR</td><td>Sigma</td><td></td><td>cacagagcctcaggacagg</td></tr><tr><td>WAVE1 reversed primer for qRT-PCR</td><td>Sigma</td><td></td><td>cttttcaccaacggcatctt</td></tr><tr><td>FastStart Essential DNA Green Master</td><td>Roche</td><td>6402712001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vivo sirna transfection and gene knockdown in spinal cord via rapid noninvasive lumbar intrathecal injections in mice

ويصف هذا التقرير دليل خطوة بخطوة لأسلوب الحقن داخل القراب إبرة حادة بطريقة موسع، أي مستقلة عن القسطرة زرع. الحد التقنية لهذه التقنية الجراحية تكمن في براعة من اليدين. حقن سريع، وخاصة بالنسبة للمجرب المدربين، ومنذ تعطل الأنسجة مع هذه التقنية هو الحد الأدنى، تكرار الحقن ممكنة؛ لا يحدث رد فعل وعلاوة على ذلك في مأمن من الأدوات الخارجية (مثل القسطرة.)، وبالتالي إعطاء محددة أفضل وأكثر من قراءة التشكيل الحبل الشوكي. منذ تطبيق هذه المادة يقتصر إلى حد كبير في المنطقة المستهدفة من الحبل الشوكي، والمخدرات، لا تحتاج إلى أن تطبق في جرعات كبيرة، والآثار غير المرغوب فيها الأهم على الأنسجة الأخرى، كما لوحظ مع التسليم النظامية، يمكن التحايل 1، 2. علاوة على ذلك، فإننا نقوم بدمج هذه التقنية في الجسم الحي مع ترنسفكأيشن من الحمض النووي بمساعدة polyethylenimالمعهد الوطني للإحصاء (PEI) كاشف 3، التي تنص على براعة هائلة لدراسة وظائف العمود الفقري عن طريق تسليم كلاء الدوائية وكذلك الجينات، والجيش الملكي النيبالي، وجهري البروتين.

<html> من أجل توضيح حقن ناجحة، أجرينا هذه التقنية باستخدام سريع الخضراء FCF الصبغة في الفئران الكبار C57BL6 (8-10 أسابيع من العمر). سمح للحيوان لاسترداد لبضع دقائق بعد الحقن لتوفير ما يكفي من الوقت للصبغة لنشر ثم قتل مع جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون 2. في وقت لاحق، تم تش?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice at JoVE.com

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

ويصف هذا التقرير تقنية بسيطة وسريعة من داخل القراب ثقب إبرة لترنسفكأيشن المترجمة من سيرنا في النخاع الشوكي القطني في الماوس تحت التخدير قصيرة ضوء دائم.

في فيفو سيرنا ترنسفكأيشن والجينات ضربة قاضية في الحبل الشوكي عن طريق السريع موسع قطني داخل القراب الحقن في الفئران

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

in-vivo-sirna-transfection-gene-knockdown-spinal-cord-via-rapid

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

46.5K Views.  University of Heidelberg.  ويصف هذا التقرير تقنية بسيطة وسريعة من داخل القراب ثقب إبرة لترنسفكأيشن المترجمة من سيرنا في النخاع الشوكي القطني في الماوس تحت التخدير قصيرة ضوء دائم. 

Video: In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Neuroscience

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

التجسيمي حقن ناقل للتلاعب الجيني الفيروسي شرطي في الحبل الشوكي ماوس

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

<meta charset="utf8"></head><body>تطوير نموذج فأر فعال ودقيق للورم الدبقي في الحبل الشوكي

Surgical Transplantation of Tumor Cells into the Spinal Cord of Mice

Spinal cord gliomas are commonly malignant tumors of the spinal cord, leading to a high rate of disability. However, uniform treatment guidelines and comprehensive data on spinal cord gliomas remain limited due to the lack of suitable preclinical animal models. Developing a simple and reproducible animal model has become essential for advancing basic and translational research. A murine model is ideal, as the murine spinal cord shares structural similarities with the human spinal cord. This protocol describes the generation of a reproducible murine model of spinal cord glioma by directly injecting tumor cells into the intervertebral space using the spinous process of the seventh cervical vertebra as a guide. Compared to other methods, this approach is more effective and convenient, involving a smaller incision, reduced invasiveness and blood loss, faster recovery, and more stable tumor formation. This model is expected to advance the understanding of disease mechanisms, optimize surgical strategies, and support the development of therapeutic drugs for spinal cord gliomas.

<meta charset="utf8"></head><body>الزرع الجراحي للخلايا السرطانية في الحبل الشوكي للفئران

The present protocol describes the development of a reproducible murine model of spinal cord glioma by injecting tumor cells into the intervertebral space, offering a more effective and less invasive approach for research and therapeutic development.

الزرع الجراحي للخلايا السرطانية في الحبل الشوكي للفئران

Spinal cord gliomas are commonly malignant tumors of the spinal cord, leading to a high rate of disability. However, uniform treatment guidelines and ...

Cancer Research

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

في نقل فيفو جين لخلايا شوان في العصب القوارض وركي من Electroporation لل

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. Using subpially-placed polyethylene catheters (PE-10 or PE-5) for AAV9 delivery, potent transgene expression through the spinal parenchyma (white and gray matter) in subpially-injected spinal segments has been demonstrated. Because of the wide range of transgenic mouse models of neurodegenerative diseases, there is a strong desire for the development of a potent central nervous system (CNS)-targeted vector delivery technique in adult mice. Accordingly, the present study describes the development of a spinal subpial vector delivery device and technique to permit safe and effective spinal AAV9 delivery in adult C57BL/6J mice. In spinally immobilized and anesthetized mice, the pia mater (cervical 1 and lumbar 1-2 spinal segmental level) was incised with a sharp 34 G needle using an XYZ manipulator. A second XYZ manipulator was then used to advance a blunt 36G needle into the lumbar and/or cervical subpial space. The AAV9 vector (3-5 &#181;L; 1.2 x 1013 genome copies (gc)) encoding green fluorescent protein (GFP) was then injected subpially. After injections, neurological function (motor and sensory) was assessed periodically, and animals were perfusion-fixed 14 days after AAV9 delivery with 4% paraformaldehyde. Analysis of horizontal or transverse spinal cord sections showed transgene expression throughout the entire spinal cord, in both gray and white matter. In addition, intense retrogradely-mediated GFP expression was seen in the descending motor axons and neurons in the motor cortex, nucleus ruber, and formatio reticularis. No neurological dysfunction was noted in any animals. These data show that the subpial vector delivery technique can successfully be used in adult mice, without causing procedure-related spinal cord injury, and is associated with highly potent transgene expression throughout the spinal neuraxis.

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

The goal of the present study was to develop and validate the potency and safety of spinal adeno-associated virus 9 (AAV9)-mediated gene delivery by using a novel subpial gene delivery technique in adult mice.

سوببيال الغدة المرتبطة فيروس 9 (AAV9) ناقلات تسليم في الفئران الكبار

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

التعبير المرتبطة بالغدة التحوير الفيروس بوساطة في المعرفة وراثيا من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, and excellent transduction efficacy in the CNS.&#160;Previous studies have demonstrated the therapeutic potency of AAV-delivered gene therapy in neurodegenerative disorders by IT administration. However, high rates of unpredictable failure due to the technical limitation of IT administration in small animals have been reported. Here, we established a scoring system to indicate the success extent of lumbar puncture in small animals by adding 1% lidocaine hydrochloride into the injection solution. We further show that the extent of transient weakness following injection can predict the transduction efficiency of AAV. Thus, this IT injection method can be used to optimize therapeutic trials in mouse models of CNS diseases that afflict wide regions of the CNS.

Here we present a direct intrathecal injection technique using 1% lidocaine hydrochloride in a viral solution to ensure efficient adeno-associated virus delivery to small animals and establish a scoring system to predict transduction efficiency in the central nervous system according to the degree of transient weakness induced by lidocaine.

حقن Intrathecal المباشر للفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف في الفئران الكبار

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. Injection directly into spinal cord tissue bypasses these barriers, providing access to cell bodies or synapses where molecules can be incorporated. Combining viral vector technology with this method allows for introduction of target genes into nervous tissue for the purpose of gene therapy or tract tracing. Here a virus engineered for highly efficient retrograde transport (HiRet) is introduced at the synapses of propriospinal interneurons (PNs) to encourage specific transport to neurons in the spinal cord and brainstem nuclei. Targeting PNs takes advantage of the numerous connections they receive from motor pathways such as the rubrospinal and reticulospinal tracts, as well as their interconnection with each other throughout spinal cord segments. Representative tracing using the HiRet vector with constitutively active green fluorescent protein (GFP) shows high fidelity details of cell bodies, axons and dendritic arbors in thoracic PNs and in reticulospinal neurons in the pontine reticular formation. HiRet incorporates well into brainstem pathways and PNs but shows age dependent integration into corticospinal tract neurons. In summary, spinal cord injection using viral vectors is a suitable method for introduction of proteins of interest into neurons of targeted tracts.

This protocol demonstrates injection of a retrogradely transportable viral vector into rat spinal cord tissue. The vector is taken up at the synapse and transported to the cell body of target neurons. This model is suitable for retrograde tracing of important spinal pathways or targeting cells for gene therapy applications.

الحقن المباشر لناقل لينتيفيرال يسلط الضوء على عدة مسارات الحركية في الحبل الشوكي الفئران

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

في فيفو سيرنا ترنسفكأيشن والجينات ضربة قاضية في الحبل الشوكي عن طريق السريع موسع قطني داخل القراب الحقن في الفئران

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

التجسيمي حقن ناقل للتلاعب الجيني الفيروسي شرطي في الحبل الشوكي ماوس

الزرع الجراحي للخلايا السرطانية في الحبل الشوكي للفئران

الزرع الجراحي للخلايا السرطانية في الحبل الشوكي للفئران

الزرع الجراحي للخلايا السرطانية في الحبل الشوكي للفئران

في نقل فيفو جين لخلايا شوان في العصب القوارض وركي من Electroporation لل

سوببيال الغدة المرتبطة فيروس 9 (AAV9) ناقلات تسليم في الفئران الكبار

التعبير المرتبطة بالغدة التحوير الفيروس بوساطة في المعرفة وراثيا من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي

حقن Intrathecal المباشر للفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف في الفئران الكبار

الحقن المباشر لناقل لينتيفيرال يسلط الضوء على عدة مسارات الحركية في الحبل الشوكي الفئران