وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) والمؤسسة الكندية للابتكار (CFI) لDWA.

1. إعداد وتشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طبق تشريح اصطف مع Sylgard. تستخدم في تشريح الأطباق (الشكل 1)؛ تسجيل من غرف WPI (مدرجة في الجدول 2 موردون ساراسوتا بولاية فلوريدا، الولايات المتحدة الأمريكية). صممت الغرف لاستيعاب الشرائح الزجاجية وتستخدم غسالات بلاستيكية صغيرة كما قوالب لSylgard. يتم إصلاح غسالات الأولى إلى الشريحة مع الشحوم ويضاف Sylgard السائل إلى مركز للغسالة. سوف Sylgard علاج بين عشية وضحاها، وكما يفعل ذلك، وأنها تشكل سرير صغير، والتعميم على شريحة زجاجية، والذي يصبح قاعدة للطبق تشريح. يتم وضع شريحة في غرفة تسجيل وبمثابة قاعدة للغرفة التي يتم تثبيتها إعداد (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول المدرجة في الجدول 3. ينبغي أن يترك حلول خارج الخلية في درجة حرارة الغرفة في حين يجب أن تبقى الحلول العقيمة داخل الخلايا. يمكن للمرء أيضا إضافة لوcifer الصفراء (0.1٪) إلى حل داخل الخلايا لذلك قد يتم تنفيذ هذا التصور من التشكل M-الخلية في نهاية التجربة. هذا يخدم لتأكيد هوية الخلية (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع نوع البرية الأجنة الزرد في الماء البيض في 28.5 درجة مئوية، وجمع والمرحلة وفقا لكيميل وآخرون 10. للتشريح، ونقل الأجنة إلى طبق تشريح الذي يشغل أيضا منصب غرفة تسجيل. تخدير لمدة 7-10 دقيقة في محلول الملح التخدير (0.02٪ تريكين؛ حل 1، الجدول 3) أن يقترب عن كثب المالحة الفسيولوجية. يمكن للمرء تحديد ما إذا كانت هي تخدير كاف عن طريق فحص استجابة لقرصة الذيل لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس الأجنة من خلال الحبل الظهري وعلى طبق Sylgard مبطنة مع 0.001 &quot;سلك التنغستن (الآلات العلمية الخدمات. شركة Ringoes، NJ، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام 25X التكبير على مجهر تشريح (الشكل 1). يتم قطع سلك التنغستن بسهولة فيإلى شرائح صغيرة مع مقص تشريح غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط التكبير على نطاق تشريح ل40-50X لأداء تشريح. بمجرد دبس الجنين إلى الطبق، والفك والعينين والدماغ الأمامي تتم إزالة باستخدام زوج من ملقط غرامة (دومون # 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومقشر الدماغ المؤخر بلطف بعيدا عن الحبل الظهري الأساسية من خلال العمل بعناية ملقط بين الحبل الظهري والدماغ. ثم يتم تشغيل الدماغ المؤخر بلطف أكثر من ذلك أن السطح البطني يواجه عقوبة تصل. يوفر هذا الموضع سهولة الوصول إلى خلايا M، والتي هي عادة في غضون 5-10 ميكرون من السطح البطني في الأجنة الشباب و~ 20-50 ميكرومتر في اليرقات الأكبر سنا (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية تمهيدا لإعداد التسجيل الذي لا يمكن أن يؤديها التجربة المشبك التصحيح. وتصور للخلايا M مع Nomarski التفاضلية التدخل التباين (DIC)، على الرغم من غيرها من طرق التصوير (أي هوفمان تعديل التباين أو التدرج Dodt التصوير التباين منLuigs ونيومان، ألمانيا) يمكن أن تستخدم أيضا. </li></ol> 2. التصحيح المشبك تسجيل (وضع خلية الجامعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ جميع التسجيلات في كل وضع المشبك التصحيح الخلية 11. توضع غرف على تسجيل مرحلة المجهر في الإعداد الكهربية. يتم إصلاحها المراحل لدينا وانسحب تستقيم المجهر المشبك التصحيح إلى منصة المجهر منقولة أو مترجمة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم سحبها ماصات التصحيح المشبك على ساحبة الأفقي (ف 97؛ سوتر الآلات شركة) من رقيقة الجدران والزجاج البورسليكات تم الحصول عليها من WPI. بأقطار ماصة غيض هي بناء على أمر من 0.2-0.4 ميكرومتر بعد تلميع النار إلى حافة على نحو سلس، وتفتق عرقوب هو ~ 4 ملم في الطول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق ماصة إلى مكبر للصوت وجها لمرحلة من مراحل الإعداد الكهربية. فمن المهم للحفاظ على مرحلة الرأس بنحو زاوية 45 درجة إلى المحور الأفقي وهذا يضمن زاوية دخول للماصة التي هي مناسبة لتشكيل عالية ختم المقاومةق على الخلية ماوتنر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقط قبل الدخول إلى حل حمام، تنطبق على كمية صغيرة من الضغط الإيجابي إلى ماصة لتقليل فرصة توسخ طرف. عند تسجيل mEPSCs، وتشمل حلول حمام 1 ميكرومتر TTX لمنع إمكانات العمل، 5 ميكرومتر الإستركنين لمنع المستقبلات الجلايسين و 10 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر bicuculline بيكروتوكسين لمنع مستقبلات GABA. عند تسجيل mIPSCs، وتشمل حلول حمام 1 ميكرومتر TTX، حمض kynurenic وإما bicuculline أو الإستركنين اعتمادا على نشاط مستقبلات المصالح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقترب من الخلايا M مع كمية صغيرة من الضغط الإيجابي في ماصة. الضغط الإيجابي يدفع بلطف الخلية من جانب إلى آخر وعند وضعه على الفور فوق الخلية، يشكل نقرة صغيرة على غشاء الخلية. ترك ماصة في المكان لبضع ثوان لتنظيف بلطف سطح الخلية بحيث يمكن تشكيل ختم قوية بين ماصة والغشاء. الافراج عن الضغط الايجابي في ماصةيسمح للختم أن يبدأ وكمية صغيرة من الضغط السلبي إلى جانب إمكانات ماصة سلبية النتائج في تشكيل الأختام GigaΩ في غضون ثوان قليلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير محتمل عقد على مكبر للصوت ل-60 بالسيارات. تمزق غشاء الخلية مع سلسلة من نبضات قصيرة من الشفط. تسجيل على الفور إمكانات غشاء وتقليل الآثار السعة. تعويض السعة الخلية (C م) وصول (سلسلة) مقاومة (R أ) عن طريق 70-85٪. R وينبغي رصد روتيني، كل 30 ثانية إلى دقيقة، وإذا كان هناك تغيير 20٪ أو أكثر، إجهاض التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن التجربة قد انتهت، وقد اكتسبت ما يكفي من البيانات، وإعداد ضحى عن طريق إزالة الدماغ المؤخر مع زوج من الملقط. عند هذه النقطة، يمكن أن تبدأ تحليل البيانات. </li></ol>

<ol>
	<li>Korn, H., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mauthner+cell+half+a+century+later:+a+neurobiological+model+for+decision-making.">The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making.</a> Neuron. 47, 13-28 (2005).</li><li>Ali, D. W., Buss, R. R., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+miniature+glutamatergic+EPSCs+in+neurons+of+the+locomotor+regions+of+the+developing+zebrafish.">Properties of miniature glutamatergic EPSCs in neurons of the locomotor regions of the developing zebrafish.</a> J. Neurophysiol. 83, 181-191 (2000).</li><li>Ali, D. W., Drapeau, P., Legendre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+spontaneous+glycinergic+currents+in+the+Mauthner+neuron+of+the+zebrafish+embryo.">Development of spontaneous glycinergic currents in the Mauthner neuron of the zebrafish embryo.</a> J. Neurophysiol. 84, 1726-1736 (2000).</li><li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish.">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).</li><li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptors+associated+with+zebrafish+Mauthner+cells+switch+subunits+during+development.">AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development.</a> J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).</li><li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKCgamma-induced+trafficking+of+AMPA+receptors+in+embryonic+zebrafish+depends+on+NSF+and+PICK1.">PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S .A. 106, 6796-6801 (2009).</li><li>Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphants:+a+new+systematic+vertebrate+functional+genomics+approach.">Morphants: a new systematic vertebrate functional genomics approach.</a> Yeast. 17, 302-306 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Tallafuss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+gene+function+ON+and+OFF+using+sense+and+antisense+photo-morpholinos+in+zebrafish.">Turning gene function ON and OFF using sense and antisense photo-morpholinos in zebrafish.</a> Development. 139, 1691-1699 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 391, 85-100 (1981).</li><li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptors+associated+with+zebrafish+Mauthner+cells+switch+subunits+during+development.">AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development.</a> J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory use of Zebrafish (Danio rerio). 1, (2007).</li><li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKCgamma-induced+trafficking+of+AMPA+receptors+in+embryonic+zebrafish+depends+on+NSF+and+PICK1.">PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6796-6801 (2009).</li><li>Patten, S. A., Roy, B., Cunningham, M. E., Stafford, J. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+Cgamma+is+a+signaling+molecule+required+for+the+developmental+speeding+of+alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate+receptor+kinetics.">Protein kinase Cgamma is a signaling molecule required for the developmental speeding of alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate receptor kinetics.</a> The European Journal of Neuroscience. 31, 1561-1573 (2010).</li><li>Kinkhabwala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+and+functional+ground+plan+for+neurons+in+the+hindbrain+of+zebrafish.">A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1164-1169 (2011).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

بروتوكول الموصوفة أعلاه يسمح احد لتصحيح سجل المشبك من M-الخلايا وhomologs لها. والتقنية هي صعبة ويجب توخي الحذر في عدة مجالات رئيسية في جميع أنحاء الداخلي. ونحن الآن نناقش بعض هذه المناطق وسوف نقدم النصائح المفيدة لضمان النجاح. بناء غرفة تشريح / تسجيل هي جانب أساسي من التجربة. والخلايا M من الصعب أن نرى ما لم يتم استخدام التدخل التفاضلية التباين. Nomarski مدينة دبي للإنترنت يعمل بشكل أفضل مع coverslips الزجاج نظيفة، ولكن وجدنا أن طبقة رقيقة جدا من Sylgard (~ 1-2 ملم) لن تشوه DIC إلى حد أنها تتعارض مع تحديد الخلايا M. وبالتالي، فإننا نستخدم غرفة تسجيل يحتوي على ساترة الزجاج رقيقة على الجزء السفلي الذي يوضع على غسالة صغيرة من البلاستيك (~ 5 مم). نحن مزيج Sylgard 184 في طبق بتري وإضافة بعناية Sylgard السائل إلى داخل غسالة مع ماصة باستور. وسيويمكن الشفاء من lgard في درجة حرارة الغرفة أكثر من بضعة أيام أو يمكن أن تكون ساخنة للعلاج السريع. قد تتم إزالة الغسالة بعد الشفاء من Sylgard، على الرغم من أن هذا ليس ضروريا. مرة واحدة أحرز غرفة التشريح / تسجيل، ويمكن استخدامه لعدة أسابيع قبل أن هناك حاجة إلى مبطنة Sylgard الزجاج الشرائح الطازجة. الخطوة التالية في هذا الإجراء هو لتعويض جميع الحلول ذات الصلة على يوم من التجربة (الجدول 3). مصنوعة حلول الخلايا التي تحتوي على كل شيء ولكن ATP وGTP مسبقا وحفظها في 5 مل aliquots في -20 درجة مئوية. في يوم تسجيل وإذابة قسامة إلى درجة حرارة الغرفة وATP الطازجة ويضاف GTP. يتم ضبط الحل ل280 الميلي أسمول ودرجة الحموضة 7.4. في أيدينا، نجد أن إضافة ATP الطازجة وGTP على النتائج يوميا في تسجيلات جيدة. تحتاج جميع الحلول لأن تبقى عقيمة للحصول على أفضل فرصة للنجاح. يجب أن تتم تصفيته حلول الخلايا ماراها مرشح 0.22 ميكرون (سيغما) لإزالة الجزيئات الصغيرة والحطام التي قد تؤثر على التسجيل. للقيام بذلك، علينا أولا رسم الحل داخل الخلايا إلى حقنة 1 مل، يضعوا مرشح لنهاية حقنة وإضافة ماصة غيض من البلاستيك التي كانت ساخنة وسحبت لطرف ما يرام، إلى نهاية التصفية. وهذا يسمح لنا لتطبيق الحل داخل الخلايا تصفيتها مباشرة إلى داخل ماصات التصحيح الزجاج. مرة واحدة يتم إعداد الحلول، الجنين يمكن تخدير وتشريح. قبل التشريح، وينبغي الحرص على تقييم كاف عمر الكائن الحي. كل جنين داخل الأعمار القابض بمعدل مختلفة قليلا. لذا عند تقييم عمر الكائن الحي من المهم أن تفعل ذلك وفقا للإجراءات المتبعة 10،13، باستخدام الإشارات phenotypical مثل عدد من somites، والشكل العام للجسم ووقت الإخصاب البيض. يتم تنفيذ كافة تشريح مع # 5 الزوج غرامة دومون منملقط. هذه تحتاج إلى أن تكون حادة وفي حالة عمل جيدة وإلا فإنه سيكون من الصعب جدا لإزالة الجلد تتراكب الدماغ المؤخر وأي النسيج الضام على السطح البطني من الدماغ المؤخر. لدينا كثير من الأحيان إلى شحذ ملقط بعد أسابيع قليلة من الاستخدام، والقيام بذلك بأنفسنا بحجر شحذ. يعلقون الأسماك إلى طبقة رقيقة من sylgard، ونحن نستخدم دبابيس صنعت من سلك التنغستن غرامة 0.001 بوصة في القطر. يتم قطع المسامير مع قديمة، مقص تشريح الصغرى تحت المجهر تشريح، وصغيرة بما يكفي لتناسب الحق من خلال الحبل الظهري. تعلق الأجنة في أي نقطة أخرى لا لشل حركة لهم، ويجعل من المستحيل تقريبا تشريح لأداء. عندما تعلم أولا لإجراء التسجيلات، قد يكون من الصعب على هوية M-خلية من homologs لها (وخاصة سم MiD2 الذي يقع في قسيم معيني المجاورة - قسيم معيني 5). في بعض الأجنة تظهر هذه أزواج اثنين من خلايا مماثلة في الحجم. الموالية otolithsبنصيحة معلما مريحة للمساعدة في تحديد M-الخلايا. في 48 HPF توجد خلايا M بجوار otoliths، وعلى الرغم من أن تتم إزالة otoliths أثناء تشريح، فإنها تترك وراءها المنطقة الجانبية بأضرار طفيفة في الدماغ المؤخر، والتي هي بمثابة علامة للحصول على مواقعها الأصلية. الأسماك المعدلة وراثيا التي تعبر عن GFP أو بعض علامة فلوري أخرى في خلايا M، وتوفير الاستعدادات ممتازة لالمجربون جديدة. في أيدينا الخلايا M لديها السعة غشاء حوالي 18-24 الجبهة الوطنية في 48 HPF، في حين أن أصغر homologs هي أقرب إلى 12-14 الجبهة الوطنية. الخلايا مع مساحة سطح أكبر يكون أكبر القيم السعة الغشاء (قياسها في الفارادات بيكو (الجبهة الوطنية)) مقارنة مع الخلايا أصغر. وبالتالي، السعة غشاء يمكن استخدامه كمؤشر تقريبي لحجم الخلية، حيث يكون خلايا أكبر القيم السعة الكبيرة. يخدم هذه الخاصية الكهربية كعقار أخرى يمكن من خلالها التعرف على الخلايا M من homologs لها. أخيرا، نحن غالبا ما تستخدم لوcifer الصفراء في تسجيل لدينا (داخل الخلايا) الحلول، والذي يسمح لنا لإجراء تحديد شركة من نوع من الخلايا قيد التحقيق باستخدام التصوير مضان مرة واحدة تسجيلات كاملة. المقاومة ماصة طرف في حدود 3.5-4.5 MΩ هي أفضل حل وسط بين حجم غيض والمقاومة وصول المنخفض الذي يتراوح عادة 8-15 MΩ. هذا مهم بشكل خاص للأحداث مع حركية سريعة؛ ~ 0.1 ميللي ثانية (20-80٪) ترتفع مرة و~ 0.5 ميللي ثانية يضمحل الأسي 12،14،15 (أرقام 3A 3B و). يتم الحصول على البيانات بمعدل 50-100 كيلو هرتز رقمنة وتصفيتها مع تردد الترددات المنخفضة من 5-10 كيلو هيرتز. فيما يتعلق ماصات التصحيح، وجدنا أنها لا تحتاج إلى أن تكون للحصول على تسجيل مصقول النار، ولكن الروايات المتناقلة، يبدو لتقديم فرصة أفضل قليلا من الحصول على الأختام جيدة مقارنة مع ماصات غير المصقول. منذ نصائح ماصة كبيرة نسبيا، ونحن لا تضيف النسخةذ الضغط الايجابي الى حد كبير الى ماصة قبل الدخول إلى الحل. سوف يستغرق الممارسة البت في كمية مناسبة من الضغط الايجابي لتطبيق مثل وجود فائض من الضغط تحريك الخلايا كثيرا، وسوف يمنع تشكيل الختم. كما قد يؤدي ذلك إلى تلف اتصالات متشابك باعتبارها الخلية والمشردين بلطف من موقعها الأصلي. من ناحية أخرى، ونتائج الضغط قليلا جدا في نصائح القذرة ولا تنظيف سطح الخلية جيدا بما فيه الكفاية لتشكيل الأختام جيدة. ويتحقق وسيط سعيدة إلا من خلال الممارسة والخبرة كبيرة. ويمكن تعزيز تشكيل ختم مع تطبيقات الفولتية السلبية إلى ماصة. لدينا عادة الأختام من 1.2-2 GΩ، والتي هي ممتازة لتحقيق اختراقات في وضع خلية كاملة. عندما تحتاج وكلاء الدوائية ليتم تطبيقها على السيتوبلازم الخلية، ونحن تدرجها في الحل داخل الخلايا قبل ملء ماصة. ينبغي توخي الحذر عند إعداد الحلول ماصة لتجنب فقدان وكلاءمن خلال وجود ذلك ربط مرشح 0.22 ميكرون. وبالتالي، فإننا تحديد المتوسطة داخل الخلايا أولا، ثم إضافة بعناية وكيل الدوائية في حل تصفيتها. تطبيق المركبات إلى حجرة داخل الخلايا لديها مجموعة فريدة من التحديات. على سبيل المثال، إضافة إلى المخدرات داخل الخلايا المتوسطة عادة ما يقلل من فرص تشكيل ختم GΩ، ولكن ليس إلى درجة أنه يشكل عائقا رئيسيا أمام التجربة. ينبغي للمرء أن يدرك أن تطبيق كلاء الدوائية في هذه الطريقة لا يسمح للمجرب لتسجيل تحكم أنسب منذ كيل لديه إمكانية الوصول الفوري إلى الخلية من بداية تكوين خلية كاملة. لذلك، في حين أننا تسجيل البيانات في جميع أنحاء هذا النوع من التجربة، يجب على المرء أن يكون على علم بأن أفضل التحكم التالي هو تطبيق الخلايا من شكل غير نشط من وكيل. في كثير من الحالات وهذا يأخذ شكل مركب الحرارة المعطل، الببتيد س تدافعتص آيزومور غير نشط تم الحصول عليها من المورد. نحن الحصول على البيانات في شكل التيارات متشابك (mPSCs)، والتيارات الجهد بوابات وإمكانات العمل. ويمكن تحليل التيارات مصغرة من قبل عدد قليل من البرامج الممتازة (pClamp، مسجل المحاور، الخ)، وعلى الرغم من أننا نفضل استخدام مسجل المحاور X (جون كليمنتس). مسجل المحاور X يعمل على كل من ويندوز وماكنتوش المنابر ويمكن استخدامها على حد سواء اقتناء وتحليل البيانات الكهربية. يتم الحصول على mEPCs مع المعونة من قالب من اختيار المجرب، والحصول عليها من تسجيل نفسها. ويمكن تحليل الأحداث الفردية لخصائص مثل الوقت الارتفاع، والسعة، ونصف العرض وتسوس الوقت، وغيرها ونحن تصدير جدول البيانات إلى Kaleidagraph (التآزر البرمجيات) حيث أننا يمكن أن تنتج الأرقام، بما في ذلك نسخ من آثار الحدث من مسجل المحاور X. أحد الجوانب أكثر صعوبة من التجربة هو تحديد ما إذا كان تم إجراء تسجيل جيدا بما فيه الكفاية لتوفير نظيفة،بيانات موثوقة. على سبيل المثال، قد تنشأ قضايا تحامل الفضاء عند تسجيل mPSCs من M-الخلايا التي تحتوي محاور عصبية كبيرة وعمليات شجيري واسعة النطاق. عندما الجهد لقط، يمكن للمرء التحكم عموما الجهد في غيض من ماصة جيدا إلى حد معقول (وخاصة إذا كانت المقاومة وصول (R أ) منخفضة)، ولكن قد لا يكون التحكم السليم للغشاء المحتملة في عمليات شجيري أو المحاور التي لا تزال بعيدة بعيدا عن غيض ماصة. أسلوب واحد من تحديد ما إذا كانت الخلية بشكل صحيح الفضاء فرضت هو إنتاج مؤامرة مبعثر من الوقت مقابل ارتفاع السعة من mPSCs تم تسجيلها. هناك ارتباط بين البيانات هو موح من عدم كفاية لقط الفضاء. وبعبارة أخرى، إذا كان المشبك الفضاء هو الفقراء ثم mPSCs التي تحدث بالقرب من ماصة سوف يكون أسرع الأوقات، وترتفع سعة أكبر من الأحداث التي تقع على مسافة بعيدة من ماصة. إذا كان ارتباط موجود، ثم البيانات هو إشكالية والتي لا يمكن استخدامها. جانب آخرمن التسجيلات الكهربية التي تحتاج إلى معالجتها هي أن التيارات تسرب. هذا ينطبق بشكل خاص عند الجهد لقط خلية لتسجيل التيارات الجهد بوابات نا مثل + K + أو التيارات. عندما انحرفت غشاء المحتملة من الراحة، يمكن تسجيل تسرب التيارات جنبا إلى جنب مع النشاط الجهد بوابات. سوف تسرب التيارات (I L)، وهو مزيج من البوتاسيوم (I K) والصوديوم (I نا) وكلوريد (I الكلورين) الحالية من خلال قنوات غير الجهد بوابات تحجب النشاط من الفائدة ويجب أن تطرح من التسجيل. مكبر للصوت قادر على أداء هذه الوظيفة على الانترنت أثناء التسجيل عن طريق تشغيل ما يسمى عادة بروتوكول P / N. خلال بروتوكول P / N سيتم تشغيل مكبر للصوت عدة depolarizations صغيرة (أو hyperpolarizations) من الراحة وسوف يسجل تسرب الناتج الحالي الذي يحدث. من المهم أن تستخدم نبضات صغيرة بما يكفي أن لا تفعيل قنوات الجهد بوابات. التياروسجلت ليالي التي تحدث خلال هذه البقول وبلغ متوسط ​​بحيث تسرب هذه التيارات يمكن تطرح من النشاط قناة الجهد بوابات. أخيرا، يحتاج المرء أن يأخذ في الاعتبار احتمال تقاطع، والذي يحدث في طرف القطب بين الخلايا وحلول خارج الخلية. عادة تتكون داخل الخلايا وحلول خارج الخلية أيونات مختلفة، مع اختلاف الأنشطة والتنقلات. سوف الأيونات أكبر مع انخفاض التنقلات تقدم أكبر لحركة المقاومة أيون من أصغر وهذا يمكن أن يؤدي إلى فرق الجهد صغيرة ولكنها مهمة عند تقاطع الحلول. يجب أن تؤخذ هذه الإمكانات تقاطع في الاعتبار عند تحديد الفولتية المناسبة التي يمر بها الخلية. تقنية المعروضة هنا هي واحدة يستخدمها مختبرنا لسنوات عديدة. ومع ذلك، هناك طرق بديلة للتسجيل من الخلايا M. وعلى الأخص، جوزيف Fetcho والزملاء وتطويرإد استعدادا الممتازة التي يمكن للمرء أن يسجل من الخلايا M-اليرقات الأكبر سنا (4-5 أيام من العمر) بطريقة أقل الغازية من المعروضة هنا، حيث اقترب من الخلايا M من السطح الظهري 16. وقد حاولنا تقنية مشابهة ولكن وجدت أنه من الأسهل الاقتراب من خلايا M من الجانب البطنية من الدماغ المؤخر، حيث الخلية هو أقرب إلى سطح الدماغ، وخصوصا في الأسماك الصغيرة (أي 24 HPF إلى 72 HPF). وعلاوة على ذلك، وهو نهج من السطح الظهري وعادة ما يتطلب استخدام خط المعدلة وراثيا التي تعبر عن علامة فلوري في M-الخلية، والتي لديها القدرة على إدخال المتغيرات إضافية في التسجيل. هذه المسألة ليست موجودة عند استخدام نوع الأسماك البرية. ومع ذلك، مع تقنية المعروضة هنا، ونحن تقتصر على دراسة الحيوانات الأصغر سنا (24 إلى 72 HPF HPF). وبالتالي، كل نهج له فوائده والقيود. اختبار t الطالب يمكن استخدامها للمقارنة بين مجموعتين من البيانات في حين أن تحليل فاريانم (أنوفا) يمكن استخدامها لمقارنة مجموعات متعددة. يجب الحرص على اختيار اختبار آخر مخصص المناسبة لحدودي مقابل البيانات غير حدودي.

واحدة من المسائل العالقة في بيولوجيا الأعصاب التنموية تتعلق دور الظواهر اللدونة متشابك خلال نضوج متشابك. تركز بحثنا على فهم آليات اللدونة التي تكمن وراء تطوير متشابك مع الهدف العام لفهم سلوك الحيوان في سياق التنمية متشابك. من أجل القيام بذلك، قمنا بتطوير إعداد سليمة إلى حد كبير في الكائن الحي (الزرد، دانيو rerio) التي اكتسبت قوة الجر كبيرة للدراسات التنموية في أواخر 1990s. الزرد يوفر مزايا عدة متميزة للدراسات النمائية العصبية. على سبيل المثال، يتم تسلسل الجينوم واحدة يمكن أن تؤدي knockdowns morpholino وبالضربة القاضية الزنك الاصبع نوكلياز لإسكات نشاط الجينات والبروتينات التعبير. يمكن للمرء أيضا إجراء دراسات من overexpression وخطوط المعدلة وراثيا يمكن بناؤها 7-9. الأجنة هي سهلة نسبيا وفيرة للحصول على وطبيعة شفافة للجنين يفسح المجال بشكل جيد للتصوير والدراسات البصريات الوراثية. بالإضافة إلى ذلك، التحليل السلوكي يمكن أن يؤديها، ويمكن القيام التجارب الكهربية على ألياف العضلات، والخلايا العصبية في النخاع الشوكي والدماغ المؤخر الخلايا العصبية في الكائنات سليمة إلى حد كبير، مما يسمح احد لفحص وظيفة الخلوية في الجسم الحي. الأهم من ذلك، نحن قادرون على دراسة النشاط متشابك وليس فقط في نفس الفئة من الخلايا، ولكن في نفس الزوج من الخلايا العصبية، من الإعداد إلى إعداد. وبعبارة أخرى، وهذا هو واحد من الاستعدادات الفقارية النادرة التي يمكن للمرء أن يعود إلى نفس الخلايا العصبية، في الموقع، لدراسة تطورها. من أجل الحفاظ على الدوائر العصبية قابلة للحياة بقدر الإمكان، وضعنا في إعداد والتي تركت الحبل الشوكي والدماغ المؤخر سليمة، في حين لقط التصحيح من الخلايا M. في هذا الإعداد، يتم إزالة العيون، والفك والجلد تتراكب الدماغ بلطف والدماغ المؤخر هو peeleد بعيدا عن الحبل الظهري، مما يتيح الوصول إلى السطح البطني من الدماغ المؤخر. توجد الخلايا العصبية الشبكي بضعة ميكرومتر عميقة ويمكن الوصول إليها بسهولة نسبيا. في 48 ساعة آخر الإخصاب (HPF؛ يتم سرد بعض الاختصارات في الجدول 1) الخلايا المدمجة كهربائيا ويمكن للمرء أن يسجل بأمانة النشاط متشابك (وكلاهما مثير والمثبطة التيارات)، والتيارات الجهد بوابات وإمكانات العمل منها. وقد اقترح النتائج التي توصلنا إليها أن العديد من جوانب التنمية متشابك والنضج تحدث في ساعة 24 قبل الفقس، وبالتالي يتركز جزء كبير من اهتمامنا على الكائنات الحية تتراوح أعمارهم من 24 إلى 72 HPF HPF. ومع ذلك، من خلال 72 HPF، M-الخلايا هي أقل إحكاما كهربائيا ويصعب بشكل صحيح المشبك الفضاء. تقنية يمكن استخدامها لتسجيل ليس فقط من الخلايا M، ولكن أيضا من لhomologs، MiD2 سم وMiD3 سم. نظريا، يمكن للمرء أيضا تنفيذ تسجيلات مزدوجة، من سالخلايا العصبية الحبل إينال مثل الخلايا العصبية الحركية الأولية ومن الخلايا M، ولكن هذا صعب ويمكن القول أن الفوائد المكتسبة من هذه التقنية صعبة قد لا يكون يستحق كل هذا الجهد الاستثنائي ما هو مطلوب.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Equipment Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting Dish</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0291</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.001" Tungsten Wire</td>
			<td>Scientific Instruments Services Inc.</td>
			<td>W406</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ9.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-97</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige Group</td>
			<td>MF-900</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Upright Patch clamp microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMLFSA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou Inc.</td>
			<td>MX7500</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digidata</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1322A</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>200B</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp9</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Axograph X</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>Axograph X</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

patch clamp recordings from embryonic zebrafish mauthner cells

خلايا ماوتنر (الخلايا M) هي الخلايا العصبية الشبكي كبيرة تقع في الدماغ المؤخر من الأسماك مكتملة العظام. فهي الخلايا العصبية الرئيسية المشاركة في السلوك المميز المعروفة باسم C-بدء أو استجابة الهروب التي تحدث عندما يدرك الكائن الحي تهديدا. وقد تم في خلايا M درس على نطاق واسع في ذهبية الكبار حيث أنه ثبت للحصول على مجموعة واسعة من مثير، وإشارات المثبطة وneuromodulatory 1. لقد تم دراسة النشاط M-خلية في الزرد الجنينية من أجل دراسة جوانب التنمية متشابك في إعداد الفقاريات. في أواخر 1990s وضعت علي وزملاؤه استعدادا لالمشبك التصحيح التسجيل من M-الخلايا في الأجنة الزرد، الذي كان CNS 2،3،4 سليمة إلى حد كبير. كان الهدف في ذلك الوقت لتسجيل نشاط الخلايا العصبية من الدماغ المؤخر متشابك، الخلايا العصبية في النخاع الشوكي والجذع العضلات والهيكل العظمي مع الحفاظ على اتصالات متشابك وظيفية ضمن إعداد الحبل الشوكي والدماغ سليمة.لا يزال يستخدم هذا المستحضر في المختبر لدينا اليوم. لدراسة الآليات الكامنة اللدونة متشابك التنموية، نسجل مثير (أمبا وNMDA بوساطة) 5،6 والمثبطة (GABA والجلايسين) التيارات متشابك من تطوير M-الخلايا. الأهم من ذلك، هذا المستحضر الفريد يسمح لنا بالعودة إلى نفس الخلية (M-الخلية) من الإعداد إلى إعداد دراسة بعناية اللدونة متشابك والعصبية التنمية في كائن حي الجنينية. الفوائد التي يقدمها هذا المستحضر تشمل 1) سليمة، واتصالات متشابك وظيفية على خلايا M، 2) التحضيرات غير مكلفة نسبيا، 3) كميات كبيرة من الأجنة متاحة بسهولة 4) القدرة على العودة إلى نفس نوع الخلايا (أي M- الخلية) في كل إعداد، لذلك أن التنمية متشابك على مستوى خلية واحدة يمكن فحص من الأسماك لصيد السمك، و5) التصوير من الاستعدادات كاملة نظرا لطبيعة شفافة من الأجنة.

في هذا المخطوط فإننا نقدم وسيلة لتسجيل التصحيح، المشبك في وضع خلية كاملة من الخلايا العصبية الشبكي في الزرد، مع التركيز بصفة خاصة على خلايا M. بطبيعة الحال، فإنه من الممكن أيضا أن يسجل في وسائط أخرى مثل المشبك التصحيح الخلية المرفقة، من الداخل إلى الخارج والخارج بها. نوع البيانات التي يمكن للمرء أن الحصول على لا يقتصر على ما قدمناه هنا، لكننا نحاول أن نقدم مثالا على حد سواء النشاط متشابك (مثير والمثبطة) في وضع الجهد المشبك فضلا عن إمكانات العمل في المشبك الحالي. والذين تتراوح أعمارهم الحي والخلايا M تطوير التشعبات أكثر شمولا وتفصيلا، للخطر القدرة على الجهد كاف المشبك المشبك ومساحة الخلية ويصبح الوضع الحالي المشبك تسجيل في الاختيار. ويبين الشكل 3 تسجيلات ممثل مثير أمبا ومستقبلات NMDA التيارات الحصول عليها من الأجنة 48 HPF في وجود TTX (1 ميكرومتر) وكلاء الدوائية لمنع GABA ومستقبلات الجلايسين. عندما الخلايا M هي الجهد فرضت في -60 بالسيارات، هي نتيجة لتنشيط مستقبلات أمبا (الشكل 3A) التيارات متشابك. اقتناء وتحليل هذه الأحداث يسمح احد لتسجيل المعلمات مثل وقت الارتفاع، وقت الاضمحلال، والسعة والتردد. أحداث أمبا وعادة ما يكون الوقت الارتفاع السريع (20-80٪ زمن صعود 0.1 ميللي ثانية ~) وتسوس الوقت (~ 0.5 ميللي ثانية)، ويحمل في المتوسط ​​ما يقرب من 25 السعة من السلطة الفلسطينية. عندما فرضت على الخلايا M في +40 بالسيارات، ومن المقرر أن أمبا وNMDA نشاط مستقبلات (أرقام 3C و 3D) التيارات الخارج الناتجة عن ذلك. NMDA مستقبلات التيارات يحمل الدورات وقتا أطول من أمبا مستقبلات التيارات، وتحتاج إلى أن تسجل في إمكانات إيجابية أو في حل الحرة المغنيسيوم لإزالة كتلة المغنيسيوم من NMDA مستقبلات 2،6. متوسط ​​mEPSC هو مبين في الشكل 3D يمثل مختلطة أمبا وNMDA التيارات المسجلة في +40 بالسيارات. فايجوري 4 تظهر نتائج ممثل عند تسجيل mIPSCs من خلايا ماوتنر. وقعت هذه الأحداث في وجود TTX (1 ميكرومتر) وحمض kynurenic (1 ملم) لمنع أمبا وNMDA المستقبلات. هذه الأحداث تظهر ارتفاع سرعة معقولة وحركية تسوس بنسبة 48 HPF ومتكررة بما يكفي للحصول على الكثير منهم أكثر من دقيقة تسجيل 3 2-3. الشكل 5 يظهر امكانات العمل المسجلة نتيجة للحقن إزالة إستقطاب الحالي في الخلية. M-48 HPF خلايا الأجنة عادة إطلاق إمكانات العمل واحد (الشكل 5B)، على الرغم من أنها في بعض الأحيان نقاط وصول متعددة اطلاق النار عندما تم حقنها مع المثيرات suprathreshold (الشكل 5A). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> الاختصار </td><td> الاسم الكامل </td></tr><tr><td> 1. </td><td> MPSC </td><td> الحالي بعد المشبكي مصغرة </td></tr><tr><td> 2. </td><td> mEPSC </td><td> مصغرة الحالي بعد المشبكي مثير </td></tr><tr><td> 2 </td><td> mIPSC </td><td> مصغرة الحالي بعد المشبكي المثبط </td></tr><tr><td> 3. </td><td> MΩ </td><td> ميجا أوم (وحدة المقاومة، و 10 أوم 6) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> GΩ </td><td> جيجا أوم (وحدة المقاومة؛ 10 9 أوم) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> الميلي أسمول </td><td> ملي أسمولي (وحدة الأسمولية؛ 10 -3 osmoles) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> TTX </td><td> سم الأسماك الرباعية الأسنان </td></tr><tr><td> 5. </td><td> ATP </td><td> الأدينوزين ثلاثي الفوسفات </td></tr><tr><td> 6. </td><td> GTP </td><td> غوانوزين ثلاثي الفوسفات </td></tr><tr><td> 7. </td><td> GFP </td><td> البروتين الفلوري الأخضر </td></tr></tbody></table> الجدول 1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; معدات اسم </td><td> شركة </td><td> عدد الكاتالوج </td></tr><tr><td> 1. </td><td> تشريح طبق </td><td> الآلات وارنر </td><td> 64-0291 </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 0.001 &quot;أسلاك التنجستن </td><td> العلمية الآلات شركة خدمات </td><td> W406 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> المجهر تشريح </td><td> لايكا مايكروسيستمز </td><td> MZ9.5 </td></tr><tr><td> 3. </td><td> ماصة بولير </td><td> سوتر الآلات شركة </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Microforge </td><td> Narishige المجموعة </td><td> MF-900 </td></tr><tr><td> 5. </td><td> تستقيم المجهر تصحيح المشبك </td><td> لايكا مايكروسيستمز </td><td> DMLFSA </td></tr><tr><td> 6. </td><td> مياداة مجهرية </td><td> Siskiyou شركة </td><td> MX7500 </td></tr><tr><td> 7. </td><td> Digidata </td><td> الأجهزة الجزيئية </td><td> 1322A </td&gt; </tr><tr><td> 8. </td><td> مكبر الصوت </td><td> الأجهزة الجزيئية </td><td> 200B </td></tr><tr><td> 9. </td><td> برنامج الحصول على </td><td> الأجهزة الجزيئية </td><td> pClamp9 </td></tr><tr><td> 10. </td><td> مسجل المحاور X </td><td> مسجل المحاور </td><td> مسجل المحاور X </td></tr></tbody></table> الجدول 2. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> اسم الحل </td><td> كاشف والتركيز (ملم) </td></tr><tr><td> 1. </td><td> تشريح الحل </td><td> 134 كلوريد الصوديوم، و 2.9 بوكل، 2.1 و CaCl 2، 1.2 MgCl 2، 10 HEPES، 10 الجلوكوز و 0.02٪ تريكين </td></tr><tr><td> 2. </td><td> حل خارج الخلية MPSC </td><td> 134 كلوريد الصوديوم، و 2.9 بوكل، 2.1 و CaCl 2، 1.2 MgCl 2، 10 HEPES، 10 الجلوكوز و0.001 TTX </td></tr><tr><td> 3. </td><td> MPSC بين الخلايا المحاليلنشوئها </td><td> 134 CSCL، 2 MgCl 2، 10 HEPES، 10 EGTA، 4 نا 2-ATP، 0.4 يثيوم GTP </td></tr><tr><td> 4. </td><td> العمل حل خارج الخلية المحتملة </td><td> 137 كلوريد الصوديوم، و 2.9 بوكل، 2.1 و CaCl 2، 1.2 MgCl 2، 10 HEPES و 10 الجلوكوز (مع 10 ميكرومتر D-توبوكورارين) </td></tr><tr><td> 5. </td><td> العمل حل بين الخلايا المحتملة </td><td> 130 بوكل، 2 كلوريد الصوديوم، 10 EGTA، 10 HEPES، 4Mg-ATP و 0.4 ليثيوم GTP. </td></tr></tbody></table> الجدول 3. تم تعديل جميع حلول خارج الخلية إلى 290 درجة الحموضة 7.8 الميلي أسمول و. تم تعديل جميع الحلول داخل الخلايا إلى 280 الميلي أسمول ودرجة الحموضة 7.4. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig1.jpg" /> الشكل 1. تشريح طبق وإعداد الحبل الشوكي، الدماغ المؤخر سليمة. (A) تشريح وتسجيل طبق الحصول عليها من WPI. وختم بعناية غسالة رقيقة على رانه شريحة زجاجية في أسفل الطبق Sylgard ويتم تطبيقها على البئر. (B) 48 HPF الدماغ المؤخر الشوكي إعداد الحبل. يواجه السطح البطني من الدماغ المؤخر صعودا ويقع على الخلايا M فقط تحت سطح الأنسجة على مستوى رأس السهم. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig2.jpg" /> الشكل 2. (أ) صورة التدخل Nomarski التفاضلية النقيض من الخلايا M تم الحصول عليها من جنين DPF 2 بعد وقت قصير من الفقس. لقد التقطت الصورة بعد تسجيل عفوية النشاط متشابك مثير من الخلايا M (B) وقد شغل الخليوي مع لوسيفر الصفراء خلال التجربة. مقتبس من 12 بإذن. <img alt="الرقم 3" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig3.jpg" /> الرقم 3. (A) mEPSCs أمبا العفوي سجلت من الخلايا M<html> في إمكانية عقد -60 بالسيارات. (B) mEPSCs متوسط ​​تم الحصول عليها من التسجيل في (A) (C) وعفوية أمبا NMDA (السهام) mEPSCs سجلت من الخلايا M في إمكانية عقد +40 بالسيارات. (D) mEPSCs متوسط ​​تم الحصول عليها من التسجيل في (C). وسجلت mEPSCs الغلوتامات في وجود TTX (1 ميكرومتر) لمنع إمكانات العمل، الإستركنين (5 ميكرومتر) وبيكروتوكسين (100 ميكرومتر) لمنع الجلايسين وGABA التيارات. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig4.jpg" /> الشكل 4. (A) mIPSCs العفوي سجلت من الخلايا M في إمكانية عقد -60 بالسيارات. (B) mEPSCs متوسط ​​تم الحصول عليها من التسجيل في (A). وسجلت mIPSCs في وجود TTX (1 ميكرومتر) لمنع إمكانات العمل، وحامض kynurenic (1 ملم) لمنع النشاط مستقبلات الغلوتامات وbicuculline (10 ميكرومتر) لمنع التيارات GABA. الإقليم الشمالي &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig5.jpg" /> الرقم 5. امكانات العمل المسجلة من الخلايا M. وفي هذا خلية معينة حافزا suprathreshold (0.48 غ) أثارت العديد من إمكانات العمل (A)، ولكن حافزا لعتبة النتائج فقط في إنتاج إمكانية عمل واحد (B). (C) البروتوكولات الحالية للآثار هو مبين في ألف وباء.

Watch this Scientific Journal Video about Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells at JoVE.com

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

طورنا في الدماغ الشوكي الحبل إعداد سليمة لتسجيل ورصد النشاط الكهربائي عبر التصحيح تسجيل المشبك من الخلايا العصبية والخلايا ماوتنر الشبكي الأخرى في الأجنة الزرد. وبالتالي، نحن قادرون على تسجيل التيارات متشابك مثير والمثبطة، والنشاط قناة الجهد بوابات وإمكانات العمل من الخلايا العصبية الرئيسية في الجنين النامية.

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا الجنينية الزرد ماوتنر

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

patch-clamp-recordings-from-embryonic-zebrafish-mauthner-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.9K Views.  University of Alberta.  طورنا في الدماغ الشوكي الحبل إعداد سليمة لتسجيل ورصد النشاط الكهربائي عبر التصحيح تسجيل المشبك من الخلايا العصبية والخلايا ماوتنر الشبكي الأخرى في الأجنة الزرد. وبالتالي، نحن قادرون على تسجيل التيارات متشابك مثير والمثبطة، والنشاط قناة ...

Video: Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الشبكية ماوس إعداد غامق تكييفها شريحة

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

المقترنة تسجيلات المشبك من تصحيح للسيارات ، والخلايا العصبية في العضلات الهيكلية الهدف اسماك الزرد

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

زراعة والكهربية من الخلايا على رقائق التصحيح، المشبك NRCC

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

تسجيلات المشبك التصحيح في الأذن الداخلية خلايا الشعر المعزولة من اسماك الزرد

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; أتباز إعداد الحويصلة وتقنية لإجراء التسجيلات المشبك التصحيح من أغشية الحويصلة Submitochondrial

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

عزل الخلايا العصبية الحسية من<em&gt; Aplysia californica</em&gt; للحصول على التسجيلات المشبك التصحيح من التيارات الجلوتاميرجي

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

خلية كاملة تسجيلات التصحيح، المشبك من Morphologically- وحددت Neurochemically-الحصين Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

تسجيلات خلية كاملة التصحيح، المشبك في الدماغ شرائح

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

التحت خلوية تسجيلات التصحيح، المشبك من المجال Somatodendritic من سودائي الدوبامين العصبية

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا الجنينية الزرد ماوتنر

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video