1. الدماغ الميتوكوندريا العزلة (مقتبس من براون MR آخرون. 9) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الفئران باستخدام أساليب وافقت عليها اللجنة استخدام المؤسسات ورعاية الحيوان (IACUC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الحيوان عن طريق قطع الرأس، وقطع الجلد وفضح الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الجمجمة بلطف عن طريق قطع مع مقص أو مقراض. إزالة الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللحم المفروم ناعما الدماغ من دون المخيخ في العزلة عازلة (انظر الجدول 1) وتحويلها إلى 5 مل زجاج / تفلون الخالط (انظر قائمة المعدات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس الأنسجة بلطف 10 مرات (أي فقاعات)، حوالي 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لعينة في 1،500 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ طاف (الميتوكوندريا وsynaptosomes) وتجاهل بيليه (المواد النووية والحطام الخلية). الطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبذطاف وإعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتر من الاحتياطي العزلة. تعطيل synaptosomes مع سفينة تمزيق الخلايا (انظر قائمة المعدات). تطبيق الضغط من 1،200 رطل لمدة 10 دقيقة، تليها إزالة الضغط السريع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة الخليط على Ficoll التدرجات (انظر الجدول 2)، ومكان في SW-50.1 الدوار وأجهزة الطرد المركزي في 126،500 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في نابذة فائقة السرعة (انظر قائمة المعدات). بيليه هو تنقية الميتوكوندريا، وطبقة بين كثافات مختلفة من Ficoll هو synaptosomes undisrupted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه بواسطة الطرد المركزي في العزلة عازلة في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي. </li></ol> 2. Submitochondrial الحويصلات (SMV) العزلة (مقتبس من تشان وآخرون. 10) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق الميتوكوندريا في 200 ميكرولتر العازلة عزل جنبا إلى جنب مع حجم مساو من 1٪ ديجيتونين والسماح للجلوس على الجليد لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المزيد من العزلة بوفإيه وأجهزة الطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي. القيام بذلك مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر العازلة عزل وإضافة 2 ميكرولتر من 10٪ Lubrol PX (C12E9). خلط والسماح للجلوس على الجليد لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خليط طبقة عازلة على العزلة، مكان في SW-50.1 الدوار وأجهزة الطرد المركزي في 182،000 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل النهائي بيليه بواسطة الطرد المركزي في جهاز للطرد المركزي المنضدي في العزلة عازلة في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li></ol> 3. تسجيل الكهربية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتضمن الكهربية تلاعب نموذجي مكبر للصوت، وجهاز كمبيوتر PC مجهزة Digidata 1440A تحويل واجهة التناظرية إلى الرقمية بالتعاون مع pClamp10.0 البرمجيات، والمتلاعبين، المجهر، جدول العزلة الاهتزاز، قفص فاراداي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تندس البورسليكات أنابيب زجاجية الشعرية إلى يلهب / براون مجتذب micropipette نموذج P-87. هو الأمثل برنامج ماصة مجتذب إلىتوليد ماصات مع المقاومة بين 80-100 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توضع SMVs في حل داخل الخلايا الفسيولوجية (يضاف ATP في الوقت المناسب أثناء التسجيل) (الجدول 3). تمتلئ ماصات المشبك التصحيح مع نفس الحل (لا ATP). يتم إجراء التسجيلات من خلال تشكيل ختم جيجا أوم على SMVs في درجة حرارة الغرفة. الحويصلات هي تصور بواسطة المجهر المرحلة على النقيض مع نيكون أو زايس مجهر مقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم الحفاظ على غشاء المحتملة في الفولتية التي تتراوح بين -100 بالسيارات إلى + 100 بالسيارات لفترات من 10 ثانية. يتم تصفيتها التسجيلات في 5 كيلو هرتز باستخدام الدوائر مكبر للصوت. مستوى الضجيج الكهربائي أو غير محددة الضالة من أقل من 1 باسكال تكون مرغوبة للتسجيل ناجحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تحليل البيانات مع Clampfit 10.0 البرمجيات على سبيل المثال لتحديد التردد والسعة من الأحداث قناة واحدة. يتم تحديد الاعتماد التيار الكهربائي من خلال التآمر علاقة الجهد الحالي. </li></ol>

<ol>
	<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival.">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li><li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease.">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li><li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis,+autophagy+and+control+of+metabolism.">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, S31-S37 (2007).</li><li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit.">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li><li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+ATP+synthase:+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits.">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li><li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bcl-2+family:+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis.">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li><li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+proteins:+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis.">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li><li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase.">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li><li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes:+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria.">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li><li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities.">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li><li>Young, H. K. o., Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+Synthasomes.">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وصفت وسائل تمكين هنا عزلة الميتوكوندريا نقية في نهاية الخطوة 1 والحويصلات submitochondrial (SMVs) بعد الخطوة 2 من الدماغ كله دون تمييز من خلية phenotypes.SMVspurified بواسطة هذه الطريقة هي مجانية أساسا من التلوث بواسطة العضيات التحت خلوية أخرى كما هو مبين في الشكل (1) والعمل الساب?...

<table><tbody><tr><td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1-7725T-5</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5424 </td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>4639 Cell Disruption Vessel</td><td>Parr Instrument Company</td><td>4639</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate centrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>P20314</td><td></td></tr><tr><td>SW-50.1 rotor </td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L8-70M Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>Lubrol PX (C12E9) </td><td>Calbiochem</td><td>205534</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B </td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A </td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>World Precision Instruments</td><td>1308325</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

f1fo atpase vesicle preparation and technique for performing patch clamp recordings of submitochondrial vesicle membranes

وتشارك الميتوكوندريا في العديد من الوظائف الخلوية الهامة بما في ذلك التمثيل الغذائي، والبقاء على قيد الحياة 1، والتنمية، والكالسيوم مما يشير 2. ترتبط اثنين من وظائف الميتوكوندريا الأكثر أهمية بالنسبة للكفاءة الإنتاج من ATP، والعملة الطاقة للخلية، من خلال الفسفرة التأكسدية، والوساطة من إشارات لموت الخلية المبرمج 3. الإنزيم المسؤول في المقام الأول لإنتاج ATP هو سينسيز ATP-F1FO، وتسمى أيضا ATP سينسيز 4-5. في السنوات الأخيرة، تلقت دور الميتوكوندريا في موت الخلايا أفكارك ونخرية اهتماما كبيرا. في موت الخلايا أفكارك، BCL-2 البروتينات الأسرة مثل باكس دخول الغشاء الخارجي الميتوكوندريا، oligomerize وpermeabilize الغشاء الخارجي، والإفراج عن العوامل الموالية لأفكارك في العصارة الخلوية 6. في موت الخلايا نخرية الكلاسيكية، مثل تلك التي ينتجها نقص التروية أو التحفيز الزائدة في الخلايا العصبية، تأه، وزيادة سيئة التنظيم في مصفوفة الكالسيوم يساهم في افتتاح مسام الغشاء الداخلي، والميتوكوندريا نفاذية المسام الانتقال أو MPTP. هذا depolarizes الغشاء الداخلي ويسبب تحولات ناضح، والمساهمة في تمزق غشاء الخارجي، وإطلاق سراح من العوامل الموالية لأفكارك، وضعف التمثيل الغذائي. العديد من البروتينات بما في ذلك بي سي إل XL 7 التفاعل مع F1FO ATP سينسيز، تحوير وظيفتها. BCL-XL يتفاعل مباشرة مع الوحيدات بيتا من F1FO ATP سينسيز، وهذا التفاعل يقلل من تصرف تسرب داخل F1FOATPasecomplex، وزيادة صافي النقل من H + من قبل F1FO خلال F1FO ATPase النشاط 8 وبالتالي زيادة كفاءة الميتوكوندريا. لدراسة النشاط والتشكيل من سينسيز ATP، ونحن عزل من القوارض الدماغ الحويصلات submitochondrial (SMVs) التي تحتوي على F1FO أتباز. وSMVs الإبقاء على السلامة الهيكلية والوظيفية للF1FO أتباز كما هو مبين في علويان وآخرون. هنا، نحن تصف طريقةالتي استخدمناها بنجاح لعزل SMVs من دماغ الفئران، ونحن ترسيم تقنية المشبك التصحيح لتحليل نشاط قناة (أيون تصرف تسرب) من SMVs.

الخطوة الأولى من بروتوكول لدينا يسمح لعزل الميتوكوندريا تنقيته كما هو موضح من قبل لطخة غربية في الشكل 1. في الشكل 2 يظهر مثال على الدماغ المستمدة submitochondrial حويصلة تسجيل التصحيح. باستخدام التكوين التصحيح من الداخل إلى الخارج ونحن لشرح نشاط قناة عن طري...

Watch this Scientific Journal Video about F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes at JoVE.com

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

ووصف طريقة لعزل الحويصلات submitochondrial المخصب في F1FO ATP مجمعات سينسيز من دماغ الفئران. هذه الحويصلات تسمح دراسة النشاط من مجمع أتباز F1FO والتشكيل وذلك باستخدام أسلوب التصحيح تسجيل المشبك.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; أتباز إعداد الحويصلة وتقنية لإجراء التسجيلات المشبك التصحيح من أغشية الحويصلة Submitochondrial

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

f1fo-atpase-vesicle-preparation-technique-for-performing-patch-clamp

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

10.2K Views.  Yale University. ووصف طريقة لعزل الحويصلات submitochondrial المخصب في F1FO ATP مجمعات سينسيز من دماغ الفئران. هذه الحويصلات تسمح دراسة النشاط من مجمع أتباز F1FO والتشكيل وذلك باستخدام أسلوب التصحيح تسجيل المشبك.

Video: F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

خالية من المنظفات فائق السرعة إعادة تشكيل بروتينات الغشاء إلى بليرس الدهن باستخدام فوسوجينيك بروتيوليبوسوميس تكميلية مشحونة.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Biochemistry

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to produce adenosine triphosphate (ATP). The isolation of the intact F1-ATPase from its native source is an essential prerequisite to characterize the enzyme&#39;s protein composition, kinetic parameters, and sensitivity to inhibitors. A highly pure and homogeneous F1-ATPase can be used for structural studies, which provide insight into molecular mechanisms of ATP synthesis and hydrolysis. This article describes a procedure for the purification of the F1-ATPase from Trypanosoma brucei, the causative agent of African trypanosomiases. The F1-ATPase is isolated from mitochondrial vesicles, which are obtained by hypotonic lysis from in vitro cultured trypanosomes. The vesicles are mechanically fragmented by sonication and the F1-ATPase is released from the inner mitochondrial membrane by the chloroform extraction. The enzymatic complex is further purified by consecutive anion exchange and size-exclusion chromatography. Sensitive mass spectrometry techniques showed that the purified complex is devoid of virtually any protein contaminants and, therefore, represents suitable material for structure determination by X-ray crystallography or cryo-electron microscopy. The isolated F1-ATPase exhibits ATP hydrolytic activity, which can be inhibited fully by sodium azide, a potent inhibitor of F-type ATP synthases. The purified complex remains stable and active for at least three days at room temperature. Precipitation by ammonium sulfate is used for long-term storage. Similar procedures have been used for the purification of F1-ATPases from mammalian and plant tissues, yeasts, or bacteria. Thus, the presented protocol can serve as a guideline for the F1-ATPase isolation from other organisms.

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

This protocol describes the purification of F1-ATPase from the cultured insect stage of Trypanosoma brucei. The procedure yields a highly pure, homogeneous, and active complex suitable for structural and enzymatic studies.

عزل و1-ATPase من "طلائعيات طفيلية" المثقبيات البروسية

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local variations in calcium ion concentration. The main molecular components involved in these processes have been identified; however, the specific interplay between calcium ion gradients and the lipids within the cell membrane is far less known, mainly due to the complex nature of biological cells and the difficultly of observation schemes. To bridge this gap, a synthetic approach is successfully implemented to reveal the localized effect of calcium ions on cell membrane mimics. Establishing a mimic to resemble the conditions within a cell is a severalfold problem. First, an adequate biomimetic model with appropriate dimensions and membrane composition is required to capture the physical properties of cells. Second, a micromanipulation setup is needed to deliver a small amount of calcium ions to a particular membrane location. Finally, an observation scheme is required to detect and record the response of the lipid membrane to the external stimulation. This article offers a detailed biomimetic approach for studying the calcium ion-membrane interaction, where a lipid vesicle system, consisting of a giant unilamellar vesicle (GUV) connected to a multilamellar vesicle (MLV), is exposed to a localized calcium gradient formed using a microinjection system. The dynamics of the ionic influence on the membrane were observed using fluorescence microscopy and recorded at video frame rates. As a result of the membrane stimulation, highly curved membrane tubular protrusions (MTPs) formed inside the GUV, oriented away from the membrane. The described approach induces the remodeling of the lipid membrane and MTP production in an entirely contactless and controlled manner. This approach introduces a means to address the details of calcium ion-membrane interactions, providing new avenues to study the mechanisms of cell membrane reshaping.

We present a technique for contactless micromanipulation of vesicles, using localized calcium ion gradients. Microinjection of a calcium ion solution, in the vicinity of a giant lipid vesicle, is utilized to remodel the lipid membrane, resulting in the production of membrane tubular protrusions.

غشاء يعيد البناء من حويصلات العملاقة في استجابة للتدرجات أيون الكالسيوم مترجمة

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Chemistry

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

منصة غشاء نموذج لإعادة تشكيل ديناميات غشاء الميتوكوندريا

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

تقييم توطين البروتين Submitochondrial في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

عزل مواقع الاتصال بالميتوكوندريا

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

تسليط الضوء على المؤلف: الكشف عن مواقع الاتصال بالميتوكوندريا والرؤى المعمارية 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

إعداد وتنقية، واستخدام الدهنية المحتوية على الأحماض الدهنية

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Bioengineering

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

إعادة تشكيل قناة كيلو فولت في الأغشية الدهنية للدراسات الهيكلية والوظيفية

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

خالية من المنظفات فائق السرعة إعادة تشكيل بروتينات الغشاء إلى بليرس الدهن باستخدام فوسوجينيك بروتيوليبوسوميس تكميلية مشحونة.

عزل و₁-ATPase من "طلائعيات طفيلية" المثقبيات البروسية

غشاء يعيد البناء من حويصلات العملاقة في استجابة للتدرجات أيون الكالسيوم مترجمة

منصة غشاء نموذج لإعادة تشكيل ديناميات غشاء الميتوكوندريا

تقييم توطين البروتين Submitochondrial في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae

طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا

طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا

طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا

إعداد وتنقية، واستخدام الدهنية المحتوية على الأحماض الدهنية

إعادة تشكيل قناة كيلو فولت في الأغشية الدهنية للدراسات الهيكلية والوظيفية