فإن الكتاب أود أن أشكر ألف بنهام للمساعدة في تطوير البروتوكول. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS06747 إلى BAB

1. إعداد الديدان عن التصوير ويستند هذا الجزء من البروتوكول بشأن جيم نشرت ويرد تقنيات زراعة ايليجانس 1،2، و في الشكل 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الديدان في ارتفاع لوحات البيبتون أجار NGM (10 سم) مع المصنف E. NA22 البكتيريا القولونية حتى تجويع تقريبا. إذا المناعية، واحد لوحة إنتاج موثوق بها الديدان يكفي لمدة 1 فرد وصمة عار، مع الأخذ بعين الاعتبار الخسائر على طول الطريق، وتستخدم معايير صارمة لتحديد الديدان للتصوير (انظر الجزء 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الديدان الحصاد وذلك بصب قليل من DDH مل 2 0 على لوحة، ويحوم لفترة وجيزة، وسكب السائل في أنبوب 15 مل المخروطية (اكرر إذا لزم الأمر لنقل اكثر من الديدان إلى أنبوب). بيليه في أجهزة الطرد المركزي السريرية لمدة 3 دقائق، ز 1000x. غسل بيليه 1-3x مع DDH 2 O حتى طاف هو واضح لإزالة البكتيريا المتبقية. استخدام ماصات نقل البولي بروبلين لإزالة supernatants، كما الديدان التمسك زجاج(من هذه الخطوة فصاعدا فإن من الأهمية بمكان لتقليل الوقت بين خطوات لتجنب الخسائر في الجدوى البيض). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الماضي، resuspend بيليه دودة في 5 مل محلول هيبوكلوريت القلوية إلى ليز الديدان وبيض الافراج عنهم. صخرة بلطف، وفحص أنابيب تحت المجهر تشريح حوالي مرة واحدة في الدقيقة الواحدة. عندما تكون هي lysed حوالي 50٪ من الديدان (أنها سوف تظهر العزم وكسر مفتوح)، إنهاء تحلل عن طريق ملء أنبوب إلى الأعلى مع الواق البيض، عدة مرات قلب، والتكوير لمدة 3 دقائق، ز 1000x. يجب أن تحلل وقت لا يتجاوز 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف مع ماصة، ونقل وغسل بيليه 3x مع الواق البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للفصل بين البيض من الحطام، وتطفو عليها على وسادة من السكروز بنسبة 30٪ في DDH 2 O: بعد غسل النهائي من الخطوة 1.4، إزالة بعناية بيليه طاف وresuspend في DDH مل 5 2 0. إضافة 5 مل العقيمة السكروز 60٪ في DDH 2 O، وتخلط جيدا. تدور في أجهزة الطرد المركزي السريرية 6 دقائق، ز 1000x. وجمع البيض في الغضروف المفصلي (سوف هكتارهاء مظهر غائم)، في حين أن الحطام سوف بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة نقل البلاستيك، تمتص البيض في حجم الحد الأدنى، ونقل إلى غير المصنف لوحات أجار NGM. ويمكن شطف أي بيض التمسك جانب أنبوب أسفل بلطف ونقل كذلك. غير المصنف واحد 10 سم لكل لوحة سلالة تحليل كاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات غير المصنف مع البيض بين عشية وضحاها (~ 16 ساعة) في 20 درجة مئوية. تنفيس عن لوحة لساعات القليلة الأولى لتجف من قبل ترك الغطاء قليلا لبضع ساعات، ولكن تأكد لتغطية بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الفقس، ونقل اليرقات L1 إلى أنبوب مخروطي 15 مل في بصل S (إضافة قليل مل S بصل إلى لوحة، دوامة، تصب في أنبوب). بيليه في أجهزة الطرد المركزي السريرية (3 دقائق، ز 1000x)، resuspend في حجم الحد الأدنى من بصل S، ونقل إلى 10 سم لوحات أجار NGM المصنف مع NA22 البكتيريا. 2 استخدام لوحات هنا للاطلاع على كل لوحة أصلية من الخطوة 1.1. احتضان الديدان حتى تصل إلى سن المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد الثقافات مرة أو مرتين في اليوم الواحد. إذا كانوا في خطر سو يتضورون جوعا، ونقل إلى لوحات NA22 الطازجة. للديدان N2 من النوع البري، ويسبق الموت جوعا من قبل تشكيل خط أو موجة من الديدان التي تنتقل عبر لوحة مثل الحيوانات تهاجر بشكل جماعي بعيدا عن مناطق الغذاء المنضب. مرة واحدة هذه الأشكال، سيتم الغذائية استنفدت تماما في غضون بضع ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الديدان هي الآن جاهزة للالمناعية أو التصوير الحي. تحديد وتلطيخ الديدان في التعليق هو الأمثل لأنه لا يمكن تصوير أعداد كبيرة من الديدان على حالها بسهولة. تلطيخ الاجراءات بناء على فيني وRuvkun 3-6 بروتوكول أفضل من تجميد شق الإجراءات لأن هناك حاجة لأعداد كبيرة من الديدان للتصوير. </li></ol> 2. مبائر التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الدود على الشرائح للتصوير مبائر. ضبط كثافة من الديدان إلى بضع مئات لكل ميكروليتر. جعل لوحة من الاغاروز 2٪ في S-القاعدية التي تحيط بها حلقة رقيقة من الفازلين لمنع تبخر أثناء التصوير (طبق عبر حقنة 3 مل مزودة إبرة قطع عيار 25). ماصة 1microliters قليل من التعليق على دودة زلة غطاء (استخدام مخدر إذا الديدان الحية التصوير)، وخفض لوحة الاغاروز على زلة غطاء، نشر الديدان بالتساوي على وسادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الديدان للتصوير. اختيار الديدان حيث نقاط الاشتباك العصبي التي تهم موجهة نحو هدف عدسة، مع تشريد شعاعي لا يزيد عن ± 45 درجة (حيث 0 درجة يعني التوجه مباشرة نحو الهدف). نفذ هذا التقييم بسرعة (بضع ثوان) لتجنب photobleaching. هو الأمثل لحجم الثقافات الأولية لضمان ما يكفي من الديدان سوف تلبي هذه المعايير الهندسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استكمال التصوير مبائر للعينة. عينات مسطح نسبيا التي يمكن شملت داخل أبواب حوالي 14 0.4 ميكرون سميكة تحقيق أفضل النتائج. السرعة العالية، والصور منخفضة الدقة (512 × 512 بيكسل) هي كافية لسرعة جمع بيانات دقيقة. تجنب تشبع كاشف مع القوة المفرطة إشارة، وهذا سوف يسبب التقليل من مضانالإشارات. </li></ol> 3. آلية تحديد وتحليل الكتل متشابك فردية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح ملفات الإخراج متعددة TIF من مجهر متحد البؤر باستخدام Volocity 4.0 (أو أعلى) والبرمجيات (PerkinElmer). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محصول بعيدا المناطق من الصورة التي لا تحتوي على بنية الفوائد (صورة -&gt; المسائل المركزية الموسعة -&gt; المحاصيل إلى اختيار&gt; اختيار منطقة ذات الاهتمام باستخدام &#39;حر عائد الاستثمار &quot;أداة - -&gt; عمليات؛ 2A الشكل). علما، والتركيز الموسعة تنتج إسقاط الطائرة Z-على شاشة الكمبيوتر للمساعدة في تحليل، ولكن لا يؤثر على البيانات الأساسية، وينطبق الشيء نفسه على التعديلات السطوع والتباين، إذا لزم الأمر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس طول منطقة تحليلها باستخدام أداة الخط. وسيتم احتساب طول الخط، وأضاف إلى جدول البيانات (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الكائنات باستخدام &quot;كائنات حسب الكثافة &#39;مرشح (المقاييس واسطة). تحديد عتبة مثل هذه التجمعات هي متشابكوأبرز وغير متشابك خلفية ليست (الشكل 2C). قد إدراج علامة 1 متشابك مستقلة المسمى مع لون آخر يساعد بشكل لا لبس فيه تحديد نقاط الاشتباك العصبي. نقاط الاشتباك العصبي نموذجي تتراوح بين بضعة لvoxels بضع مئات. تعيين العتبة مرة واحدة باستخدام عينة السيطرة، واستخدامها لجميع العينات اللاحقة. العتبة كل عينة على حدة هو أمر غير مقبول لأنه يقدم احتمال التحيز مجرب. ويتم اختيار الأشياء وجدولتها تلقائيا (الشكل 2D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترتيب وتصدير البيانات. القضاء على الكائنات من 2 أو أقل voxels، لأن هذه عادة ما تكون بقع خلفية. يمكن القضاء على هذه من خلال تصفية أخرى، أو خلال تحليل لاحق. لتسهيل المصب إزالتها، وإعادة ترتيب ملف البيانات بواسطة &quot;حجم الكائن إرادة بحيث كل مجموعة معا. تصدير البيانات في تنسيق CSV، والتي يمكن فتحها بواسطة Microsoft Excel أو برامج جداول البيانات الأخرى. وتنتج كل صورة من ملف واحد الانتاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا Volocity الناعمةسلعة غير متوفرة، وسائل بديلة لتحليل Z-طائرة التوقعات للبيانات مبائر يمكن استخدام (المرجع على سبيل المثال. 7، أو تحليل اليدوي باستخدام يماغيج)، على الرغم من فقدان 3 الابعاد المعلومات (انظر المناقشة). </li></ol> 4. ممثل النتائج وينبغي أن الأسلوب الكمي قدم يكون قادرا على التمييز بين السكان مجموعة من سطوع مختلفة وأحجام مختلفة. صور ممثل والبيانات الكمية المقابلة التي قدمت في الشكل (3) إظهار أمثلة على التمييز على أساس هذه المعايير. وكقاعدة عامة يجب أن النتائج تتوافق مع ما هو واضح للعين. في حالة مستقبلات UNC-49 GABA المناعية للنخاع العصب بطني من C. ايليجانس، جميع الحيوانات ظهرت عادة متشابهة جدا من حيث الحجم والنضج، ومجموع قيم مضان متشابك لمجموعة من خمسة ديدان (طبيعية لطول الحبل العصب تحليل) أظهرت الخطأ المعياري<html> قيم حوالي 10٪ من ال 4 متوسط. قد طفرة جينية وعلاجات تجريبية أخرى (مثل التعرض للمخدرات) تغيير ليس فقط في حجم وقيم الكثافة وتوزيع الترددات من مجموعات متشابك، ولكن ربما التنموية للوقت الدورة والتزامن من الديدان، مما أدى إلى ارتفاع التقلبات. لكن يجب أن النتائج الكمية تعكس دائما ما يمكن أن يكون موضع تقدير بصريا وإذا لم يكن، والتفتيش من الصور والكائنات التي تم تحديدها من قبل Volocity ينبغي الكشف عن مكان وقوع الخطأ، واقتراح إجراءات تصحيحية مثل العتبة إعادة أو إزالة الكائنات مصطنع. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig1.jpg" /> الشكل 1. إعداد جيم متزامن ويتم الحصول على ايليجانس الثقافات. الثقافات متزامن من هذا الإجراء لأنه C. الاعتقالات تنمية ايليجانس والمرحلة L1 اليرقات في حالة عدم وجود الغذاء، ويستأنف عند تقديم الطعام. <html> ove_content &quot;&gt; <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig2.jpg" /> الشكل 2. تحديد الكميات من نقاط ومتشابك. <ol class="ualpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتفجرت مناطق خارجة من الصورة لتقليل حجم الملفات وزيادة الدقة. اليسار لوحة جهة يظهر بدءا صورة، وسط لوحة تظهر منطقة محددة، لوحة اليمين يظهر صورة بعد الحصاد. أحمر إشارة UNC-49 مستقبلات GABA المناعي، إشارة خضراء synaptobrevin-GFP (علامة قبل المشبكي) التي أعرب عنها في الخلايا العصبية قبل المشبكي GABA 4. <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2alarge.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم رسم خط على طول العصب قطعة الحبل السري ليتم تحليلها، ويتم تسجيلها تلقائيا طوله في جدول النتائج. هذه المعلومات ضرورية لتطبيع البيانات متشابك نظرا لطول الحبل العصبي للتحليل، والتي يمكن أن تختلف عدة مرات إذا الديدان تصبح مجزأة خلال تلطيخ.jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; اضغط هنا لعرض أكبر شخصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويطبق عتبة لتحديد مجموعات متشابك الفردية. لوحة اليسار يظهر صورة قبل العتبة، وترد أمثلة على مستويات العتبة مختلفة في لوحات منفصلة (إشارة خضراء محذوف). ويصور كل كائن التعرف على صورة ملونة مثل منطقة. لاحظ التوافق بين الكتل ومتشابك واضح بصريا في اللوحة أقصى اليمين والمناطق الملونة على لوحة أقصى اليمين. <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2clarge.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم سرد كل كائن التي تم تحديدها بشكل منفصل في جدول النتائج. ويمكن اختيار الكائنات الفردية، ويتم تسليط الضوء على الصورة للتفتيش عند الرغبة في ذلك. لاحظ أن الجدول يحتوي على معلومات عن أحمر (&#39;رودامين&#39;) والأخضر (&#39;EGFP&#39;) قنوات، وقناة المعلومات الخضراء مضللا منذ الكائنات كانتحدد بشكل صارم على اساس مضان أحمر. ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ هذا التحليل على الصور لون واحد. <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2dlarge.jpg" target="_blank">اضغط هنا لعرض أكبر شخصية</a> . </li></ol><img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig3.jpg" /> الشكل 3. نتائج ممثل. الميكروسكوب الممثل من البرية من نوع C. ايليجانس ملطخة لمستقبلات UNC 49-GABA قبل (A) وبعد (B) مع العلاج muscimol، ناهض مستقبلات GABA التي تسبب المستقبلات لتصبح downregulated بعد التعرض الطويل لوحات تظهر الصور تفجرت قبل (يسار) وبعد (يمين) العتبة وازالة بقع خلفية صغيرة. (ج) من مؤامرات المعلمات متشابك الكمي للعينات هو مبين في (أ) و (ب): مضان مجموع طبيعية لطول الحبل العصب (يسار)، ورسوم بيانية الاحتمال التراكمي للفرد المشبك محتوى مضان (وسط) والمشبك حجم (righر)، مما يدل على انخفاض كبير إحصائيا في محتوى متشابك وحجم الناجمة عن التعرض ناهض (ن = 60 نقاط الاشتباك العصبي للعلاج، ن 115 = نقاط الاشتباك العصبي للالمعاملة muscimol، P &lt;0.001، كولموغوروف-سميرنوف اختبار <a href="http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html" target="_blank">http://www.physics.csbsju .edu / احصائيات / KS-test.html</a> ).

<ol>
	<li>Christensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells.">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33, 503-514 (2002).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122, 2517-2527 (1996).</li><li>Davis, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+lysosomal+trafficking+as+a+mechanism+for+regulating+GABAA+receptor+abundance+at+synapses+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Rowland, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+terminals+independently+regulate+synaptic+clustering+and+autophagy+of+GABAA+receptors+in+Caenorhabditis+elegans.">Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).</li><li>Burbea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+AP180+regulate+the+abundance+of+GLR-1+glutamate+receptors+at+postsynaptic+elements+in+C.+elegans.">Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans.</a> Neuron. 35, 107-120 (2002).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+regulated+by+the+insulin-like+signaling+pathway+underlies+salt+chemotaxis+learning+in+Caenorhabditis+elegans.">Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).</li><li>Sankaranarayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>McDonald, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+functional+characterization+of+fluorescent,+N-terminally+tagged+CB1+receptor+chimeras+for+live-cell+imaging.">Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging.</a> Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).</li><li>Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+neuropeptide+release+induced+by+octopamine+without+Ca2++entry+into+the+nerve+terminal.">Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تم تصميم طريقة عرض هنا لاستخراج كمية متعددة المعلمة بيانات عن أعداد كبيرة من نقاط الاشتباك العصبي في C. ايليجانس، في حين تحقيق أقصى قدر من الاتساق ضمن مجموعات العلاج. ثلاث ميزات تسهم في تحقيق هذه الأهداف. أولا، يتم تنفيذ المناعية على السكان دودة متزامن للتأكد من ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم البرنامج </td><td> شركة </td><td></td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td> Volocity V4.0 أو أعلى </td><td> PerkinElmer / Improvision </td><td></td><td> تحقق الأساسية الخاصة بك التصوير المحلية منشأة من أجل الوصول إلى هذا البرنامج. البرنامج التجريبي هو متاح على موقع PerkinElmer. يتطلب هذا الأسلوب فقط وحدة تحديد الكميات من Volocity. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 2. كواشف ومعدات معينة. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> بيضة العازلة </td><td> كلوريد الصوديوم بوكل CaCl 2 MgCl 2 HEPES (ضبط درجة الحموضة إلى 7.3) </td> &lt;TD&gt; 118 ملي 48 ملم 2 مم 2 مم 24 ملم </td></tr><tr><td> القلوية هيبوكلوريت (لمدة 5 مل) </td><td> جديد التبييض المنزلي (تجاهل زجاجة بعد 30 يوما من الافتتاح) 10 N هيدروكسيد الصوديوم DDH 2 O </td><td> 1.0 مل 0.25 مل 3.75 مل </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول رقم 1. حلول. </td></tr></tbody></table>

automated quantification of synaptic fluorescence in c. elegans

قوة المشبك يشير إلى اتساع ردود بعد المشبكي إلى إطلاق سراح الأحداث قبل المشبكي العصبي، ولها تأثير كبير على وظيفة الكلية الدائرة العصبية. قوة المشبك يتوقف بصورة حاسمة على وفرة من المستقبلات العصبية تتجمع في مواقع متشابك على الغشاء بعد المشبكي. يتم تحديد مستويات مستقبلات تنمويا، ويمكن تغييرها من قبل الاتجار مستقبلات بين برك السطحية المحلية، تحت المشبك، والخلايا، التي تمثل آليات هامة من اللدونة متشابك وتعديل العمليات العصبية. طرق صارمة لتحديد synaptically المموضع وفرة مستقبلات الناقل العصبي ضرورية لدراسة تطوير واللدونة متشابك. مضان المجهري هو النهج الأمثل لأنه يحافظ على المعلومات المكانية، والتمييز متشابك من غير متشابك حمامات، والتمييز بين السكان مستقبلات مترجمة إلى أنواع مختلفة من نقاط الاشتباك العصبي. الكائن الحي نموذج الجيني Caenorhabditis eleganوبشكل خاص يناسب ق لهذه الدراسات نظرا لصغر حجمها وبساطة النسبي للنظام العصبي، وشفافيتها، ومدى توافر تقنيات وراثية قوية، مما يسمح للفحص من نقاط الاشتباك العصبي في الحيوانات الأصلية سليمة. هنا نقدم وسيلة لقياس fluorescently المسمى المستقبلات العصبية متشابك في C. ايليجانس. وتتمثل الميزة الرئيسية هي تحديد الآلية وتحليل نقاط الاشتباك العصبي الفردية في ثلاثة أبعاد متعددة في طائرة مبائر ملفات الإخراج المجهر، موقف تبويب، وحجم وكثافة مضان، ومضان الإجمالية لكل المشبك. هذا النهج ميزتان الرئيسية خلال التحليل اليدوي للZ-طائرة التوقعات للبيانات مبائر. أولا، لأنه يتم تضمين كل طائرة من مجموعة البيانات مبائر، يتم فقدان أي بيانات من خلال Z-إسقاط طائرة، تقوم عادة على المعدلات كثافة بكسل أو الحدود القصوى. الثانية، وتحديد نقاط الاشتباك العصبي هو الآلي، ولكن يمكن للتفتيش من قبل القوات المسلحة الرواندية السابقةperimenter كما عائدات تحليل البيانات، مما يتيح استخلاص سريعة ودقيقة للبيانات من عدد كبير من نقاط الاشتباك العصبي. ويمكن بسهولة لمئات الآلاف من نقاط الاشتباك العصبي في عينة يمكن الحصول عليها، وتنتج مجموعات البيانات الكبيرة إلى تحقيق أقصى قدر من القوة الإحصائية. اعتبارات لإعداد C. وتناقش أيضا ايليجانس لتحليلها، وإجراء التصوير مبائر للحد من التباين بين الحيوانات ضمن مجموعات العلاج. على الرغم من أن وضعت لتحليل C. مستقبلات ايليجانس بعد المشبكي، وهذه الطريقة مفيدة بشكل عام في أي نوع من synaptically المموضع البروتين، أو في الواقع، أي إشارة مضان أن يكون موضعيا إلى مجموعات منفصلة، ​​ونقاط و، أو العضيات. يتم تنفيذ الإجراء في ثلاث خطوات: 1) إعداد العينات، 2) التصوير مبائر، و 3) تحليل الصور. الخطوات 1 و 2 هي محددة لC. ايليجانس، في حين أن الخطوة 3 تنطبق بصورة عامة على أي إشارة مضان منقط في الميكروسكوب متحد البؤر.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans at JoVE.com

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

وفرة من المستقبلات العصبية تتجمع في نقاط الاشتباك العصبي تؤثر تأثيرا قويا قوة متشابك. هذا الأسلوب الكمي المستقبلات العصبية fluorescently المسمى في ثلاثة أبعاد مع قرار واحد في المشبك<em&gt; C. ايليجانس</em&gt;، مما يسمح للمئات من نقاط الاشتباك العصبي يتميز بسرعة في عينة واحدة من دون التشوهات التي أدخلتها Z-طائرة الإسقاط.

الآلي الكمي من الإسفار متشابك في<em&gt; C. ايليجانس</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

automated-quantification-of-synaptic-fluorescence-in-c-elegans

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

10.2K Views.  University of Toledo. وفرة من المستقبلات العصبية تتجمع في نقاط الاشتباك العصبي تؤثر تأثيرا قويا قوة متشابك. هذا الأسلوب الكمي المستقبلات العصبية fluorescently المسمى في ثلاثة أبعاد مع قرار واحد في المشبك C. ايليجانس، مما يسمح للمئات من نقاط الاشتباك العصبي يتميز بسرعة في عينة واحد?...

Video: Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

يعاير β اميلويد السمية باستخدام المعدلة وراثيا C. ايليجانس النموذجي

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

في Axotomy الليزر المجراة في C. ايليجانس

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

المقررة الإنتشار الأفقي والإيماس من غشاء بروتينات في الخلايا العصبية مثقف باستخدام الاسترداد الإسفار وPhotobleaching الإسفار الخسارة

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. ايليجانس تتبع وقياس السلوكية

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A قراءات الجزيئية من التكيف على المدى الطويل في الشم<em&gt; C. ايليجانس</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

بعد تضمين التعريف Immunogold من البروتينات متشابك في الثقافات شريحة الحصين

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

اشتقاق مدار الساعة من تخليص الغلوتامات مع تحليل Deconvolution من التيارات الناقل نجمي

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

في فيفو التصوير من داور محددة العصبية في إعادة عرض C. ايليجانس

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

الآلي الكمي من الإسفار متشابك في

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video