نود أن نشكر الأعضاء الحاليين والسابقين في المختبر وصله الذي ساعد في تطوير بروتوكولات الموصوفة هنا ، ولا سيما الجن فونتي ، الذي طور الإجراء الأصلي. وقد تم دعم هذا العمل من الجوائز من المعاهد الوطنية للصحة (AG12423) وجمعية الزهايمر (زينيث جائزة) لCDL

1) إعداد النيماتودا نمو وسائل الإعلام لوحات لفحص الشلل. وتجرى فحوصات الشلل على نمو النيماتودا القياسية لوحات (NGM) تستخدم بشكل روتيني وسائل الإعلام لجيم ايليجانس الانتشار وعلم الوراثة (Stiernagle ، 2006). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف الحل NGM تحتوي على كلوريد الصوديوم ، وآجار ببتون في دورق مخروطي وإضافة كميات مناسبة من CaCl العقيمة 2 ، يوراسيل ، الكولسترول ، MgSO 4 و 1M 1M KPO 4. قسامة 10 مل من السائل في كل NGM 60 ملم × 15 ملم طبق بيتري. السماح لترسيخ NGM بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان اختبار للآثار مركبات / مقتطفات ، قسامة في كل لوحة على استخراج واستخدام رش لتوزيع متساو للاستخراج على سطح اللوحة. السماح لاستخراج الجافة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. وأحجام أكثر من 1 مل تتطلب المزيد من الوقت لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل لوحة البقعة مع 250 ميكرولتر من E. القولونية OP5O سلالة نمت في وسائل الإعلام LB بين عشية وضحاها لكثافة بصرية من 0،4-0،6. تسمح للبكتيريا لتجف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. </li></ol> المتغيرات ذات الصلة سن لوحات له تأثير كبير على مقايسة الشلل ، كما أقدم لوحات تميل إلى أن تجف. صب لوحات استخدام في غضون أسبوع من مقايسة الشلل. لنتائج مثالية ، صب لوحات 3-4 أيام قبل بدء السكان دودة متزامن [انظر : (2) أدناه]. عن أي تجربة ، فقط استخدام لوحات تدفقت من نفس الدفعة. وسوف يغير حجم العشب (أي رصدت مقابل انتشار) و / أو نوع من البكتيريا أيضا تغيير سلوك الديدان. يمكن إجراء فحوصات الشلل باستخدام بديل E. سلالات بكتيريا كمصدر للغذاء (مثل السلالة المستخدمة في تغذية HT115 التجارب رني) ، ولكن هذا لا يمكن تغيير حركية من الشلل ، مما يتطلب وضع ضوابط داخلية ملائمة. 2) إعداد بالسكان دودة السن متزامن CL4176 سلالة (SMG - 1 (cc546 TS) الأول ؛ dvIs27 [ميو - 3 / Aβ ​​minigene + رول - 6 الجين علامة (su1006)] X هو الأكثر استخداما لمعايرة Aβ الشلل الناجم عن هذه السلالة المعدلة وراثيا والنماذج الأخرى المتاحة. إلى الباحثين الأكاديميين لقاء رسم رمزي من مركز علم الوراثة انواع معينة (http://www.cbs.umn.edu/CGC/). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعظيم التزامن العمري للسكان اختبار فمن الأفضل أن تبدأ مع جيل الآباء متزامنة. قبل اسبوع من بدء الفحص الشلل من السكان اختبار ، واستخدام منتقي الدودة البلاتين لنقل 20-30 حامل البالغين على عدة لوحات NGM 10 سم مع انتشار OP50 عن البيضة 2 ساعة في وضع 16 درجة مئوية (درجة حرارة متساهلة للCL4176 ). إزالة حامل البالغين والسماح للنسل لتنمو لمدة 7 أيام ، وهو الوقت الذي سوف يكون &quot;اليوم الثاني&quot; البالغين حامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (يوم 1) وتستخدم الكبار اليوم الثاني حامل لإعداد السكان اختبار العمر متزامن. لكل حالة الكائن التجريبي لتوليد ثلاث نسخ لوحات تحتوي على 50-75 سن متزامن مع الديدان. استخدام البلاتين منتقي الدودة ، ونقل 10-12 من البالغين 2 يوم 60 ملم على حامل (10 مل الحجم) لوحات NGM رصدت مع OP50. السماح للديدان لوضع البيض على 16 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ، ثم اختيار قبالة البالغين والسماح فقس البيض وتنمو بمعدل 16 درجة مئوية. عند هذه النقطة فمن الأفضل أن يكون هناك شخص لن تكون لوحات تسجيل لرمز لهم ، لذلك سيكون هداف الأعمى للظروف تجريبية. </li></ol> المتغيرات ذات الصلة مرحلة التطور الجنيني عندما يتم وضع البيض (~ مرحلة 26 خلية للديدان نوع البرية تحت الظروف المثلى) هي وظيفة من سن البلوغ والتغذية. إذا كان الكبار حامل المستخدمة في إعداد واختبار السكان هم من كبار السن أو جوعا ، سيتم وضع البيض مرحلة لاحقة ، مما يقلل من التزامن العمري للسكان واستنساخ حركية الشلل. لا بد من أحادية ممحوضة (أي ، فقط OP50 البكتيريا) تستخدم الثقافات (الملوثات الجرثومية يمكن أن تؤثر بشدة على هذا الاختبار) ، واستنساخ هو أعلى إذا كان لديك أرقام لوحات ثلاث نسخ مماثلة من الديدان. 3) والتحوير التعريفي الفحص الشلل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اليوم 3) لوحات التروس إلى 25 درجة مئوية بعد 48 ساعة من نهاية متزامن وضع البيض ؛ الديدان وينبغي في هذه المرحلة اليرقات الثالث (L3). وينبغي تنظيم لوحات دون التراص في الحاضنة 25 درجة مئوية للسماح لجميع لوحات لتصل إلى 25 درجة مئوية في نفس الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (يوم 4) بيغن بتسجيله الشلل من الديدان (سلالة CL4176) في 18-20 ساعة بعد بدء التروس. عند هذه النقطة ، يجب أن تصل إلى جميع الديدان في سكان اليرقات الرابعة (L4) المرحلة. يستمر التسجيل لمدة ساعتين في زيادات حتى يتم شل كل الديدان على كل من لوحات. لأسباب غير معروفة ، والشلل ليست حتى في طول الجسم : منطقة الرأس هو الجزء الأخير من الدودة إلى وقف التحرك. وبالتالي ، ثيمكن orms التي شرعت مؤخرا الشلل لم يترجم عبر لوحة ، ولكن يمكن ان تتحرك رؤوسهم ، ومن ثم تبادل المعلومات حول بكتيريا الأمامي ، وترك &quot;هالة&quot; من البكتيريا تطهيرها. وسوف تصبح هذه الديدان دائما بالشلل التام ، وبالتالي يتم تصنيف الديدان مع هالات كما بالشلل. وبعض الديدان ولكن لم يكن لديك هالات أيضا لن تظهر الحركة العفوية ، ويتم اختبار هذه بواسطة الحث مع لاقط دودة. إذا كان لا يمكن أن دودة حث الخضوع لكامل الجسم موجة الانتشار على الحث ، كما أنه سجل في بالشلل. لتسجيل فعالة ، فمن الأسهل لنقل الديدان بالشلل إلى القطاع غير مرقط من لوحة بحيث أنها لن تكون بدون قصد rescored فترة التسجيل المقبلة. (وهذا ما يسمح أيضا سوء تصنيف الديدان لإظهار الحركة ، والسماح لتصحيح الدرجات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنشاء منحنى الشلل ، في كل نقطة زمنية يتم تحويل جزء من الديدان على كل صفيحة التي لم بالشلل إلى نسبة مئوية ، ويتم رسم المتوسط ​​&quot;unparalyzed&quot; النسبة المئوية ضد الزمن من بدء تغيير التروس. (والأساس المنطقي لتآمره في هذه الطريقة هو أن منحنى الناتج هو مماثل رسميا إلى منحنى البقاء ، وبالتالي يمكن تحليلها باستخدام معيار بقاء الإحصاءات غير المعلمية). </li></ol> المتغيرات ذات الصلة يجب أن تكون التروس من الديدان myo-3/Aβ المعدلة وراثيا يحدث قبل أن تصل إلى مرحلة منتصف L4 للشلل إلى أن تبدأ ، كما يتم تنظيم وتنمويا - 3 ميو المروج ، وخفضت إلى حد كبير في التعبير L4 في وقت متأخر أو الديدان البالغة. وبالمثل ، تم حظر التعبير عن هذا التحوير إذا أصبحت الديدان جوعا ، ولذلك فمن الضروري أن الديدان التي تتغذى بشكل جيد في كافة مراحل التجربة. نحن لم يلاحظ وجود دودة بالشلل لاستعادة تحت أي ظرف من الظروف ، وبعد 12-16 ساعة من التروس ، وجميع الديدان CL4176 سوف تشل ، حتى لو كانوا downshifted إلى 16 درجة مئوية. في سلالة CL4176 ، upregulation كافية للتعبير التحوير يسبب الشلل يمكن أن يحدث في درجات حرارة منخفضة (أي ، 20-25 درجة مئوية) على الرغم من أن يتم تغيير توقيت الشلل. معدل الشلل يعتمد على سلالة معدلة وراثيا المحددة المستخدمة (لدينا سلالات myo-3/Aβ شيدت مع كل من معدلات أسرع وأبطأ من CL4176) ، وذلك مع سلالات بديلة قد احرز إطار الحاجة إلى تعديلها. نتائج الممثل 4) هو مبين في الشكل رقم 1 هو مؤامرة من منحنى لCL4176 الشلل ، وكلاهما غير المعالجة ، ويتعرض ل6.27 ملي الكافيين (تركيز النهائي في لوحة NGM). نتائج هذا العلاج في تأخير كبير إحصائيا في شلل ما يقرب من 4 ساعات ، وهو ما يفسر كمؤشر إلى قمع سمية Aβ في هذا النموذج. هو مبين في الشكل 2 هو تجربة مستقلة يعاير آثار cafestol ، وآخر مركب موجود في القهوة. هذا المخطط هو الحال بالنسبة للعلاجات التي لا تؤثر سمية Aβ. علما أنه في كل التجارب مشلولة حوالي نصف السكان في علاج CL4176 24 ساعة ، والشلل اكتمال بحلول 28 ساعة. هذه هي الأطر الزمنية النموذجية للشلل السكان CL4176 السيطرة. انحرافات كبيرة من هذا التوقيت تدل على تغيير الظروف البيئية أو الحذف التلقائي للنسخ التحوير. (CL4176 يحتوي على مجموعة متكاملة صبغويا المعدلة وراثيا مع نسخ متعددة من التحوير myo-3/Aβ. المعدلة وراثيا على الرغم من أن هذه المجموعة هي عادة مستقرة تماما ، أي انتشار للسلالة في درجات حرارة&gt; 16 درجة مئوية وحدد للديدان النادرة التي خضعت لعملية عفوية حذف الجينات المحورة ، مما أسفر عن المتغيرات التي من شأنها أن خفضت التعبير Aβ والنتائج أبطأ الشلل). <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. منحنى الشلل لسلالة CL4176 الديدان غير المعالجة أو المعرضين لمادة الكافيين 6.27 ملي (سيغما) ، وأشار مرة هم من الشروع في تغيير التروس درجات الحرارة. أشرطة الخطأ = SEM <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. أشرطة خطأ منحنى الشلل لCL4176 الديدان تتعرض لcafestol 0.48 ملي (سيجما) = SEM

<ol>
	<li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer's+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans.">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li><li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity.">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li><li>Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+phenotyping+of+a+transgenic+C.+elegans+expressing+neuronal+amyloid-beta.">Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta.</a> J Alzheimers Dis. , (2009).</li><li>Drake, J., Link, C. D., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+precedes+fibrillar+deposition+of+Alzheimer's+disease+amyloid+beta-peptide+(1-42)+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+model.">Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model.</a> Neurobiol Aging. 24, 415-4120 (2003).</li><li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+aggregation+of+beta-amyloid+peptide+variants.">In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants.</a> J Neurochem. 71, 1616-1625 (1998).</li><li>Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+insulin-receptor+signaling+promotes+the+autophagic+degradation+of+beta-amyloid+peptide+in+C.+elegans.">Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans.</a> Autophagy. 3, 569-580 (2007).</li><li>Fonte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+in+vivo+beta-amyloid+peptide+toxicity+by+overexpression+of+the+HSP-16.2+small+chaperone+protein.">Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein.</a> J Biol Chem. 283, 784-7891 (2008).</li><li>Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIP-1+ameliorates+beta-amyloid+peptide+toxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer's+disease+model.">AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Hum Mol Genet. 18, 2739-2747 (2009).</li><li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9368-9372 (1995).</li><li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer's+disease+model.">Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Neurobiol Aging. 24, 397-413 (2003).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ويمكن للبروتوكول وصفناها استخدامها بفعالية لفحص آثار سمية المركبات على Aβ. نشرت الأمثلة تشمل آثار المكونة الجنكه بيلوبا انتزاع (وو وآخرون 2006) وريزيربين (آريا آخرون 2009). كما تم المركبات التي تم واقية ضد سمية Aβ في أنظمة أخرى أظهرت أن تكون وقائية في هذا النموذج (على سبيل المثال ، memantine ، نتائجنا غير منشورة). والأساس المنطقي لإنشاء مهمة هذا النموذج هو أن الأدوات المتطورة الوراثية والجزيئية المتاحة في C. ويمكن استخدام آليات للتحقيق في ايليجانس سمية Aβ. وبالتالي ، يمكن أن يعاير الطفرات آثار محددة على Aβ سمية (على سبيل المثال ، فإن تأثير الحد الذي يشبه الانسولين عن طريق إدخال إشارة DAF - 2 - فقدان وظيفة من الطفرات وفلوريز ، مكلور وآخرون 2007) ، وهذا النموذج يمكن أيضا يمكن استخدامها لدراسة آثار الإفراط في التعبير عن الجينات المحورة (فونتي وآخرون 2008). لقد قمنا مؤخرا الاستخدام الواسع النطاق لهذا النموذج لدراسة الآثار المترتبة على سمية واحدة استبدال الأحماض الأمينية في Aβ (بيانات غير منشورة). وصف النموذج المعدلة وراثيا هنا المقايسات تأثير التعبير Aβ الحاد على وظيفة الخلايا العضلية. في ذلك الوقت من خلايا العضلات والشلل قسيم عضلي هم سليمة ، والشلل هو النمط الظاهري ليست نتيجة لموت الخلايا العضلية. ومع ذلك ، بعد الشلل (~ 48 ساعة بعد تغيير التروس الأولي) أن هناك توزيعا للسلامة العضلات والموت في نهاية المطاف من الديدان. نحن لم نحقق هذا الغرض المصب التعبير Aβ أو استخدامه كعلامة السمية. التعبير Aβ نموذج محرض صفها هنا ليست مناسبة للتحقيق في العلاجات التي تعدل تشكيل β اميلويد في حد ذاتها. على الرغم من أن الديدان المعدلة وراثيا مع التأسيسية Aβ شكل التعبير الودائع اميلويد كشفها بسهولة (فاي وآخرون 1998 ؛. رابط وآخرون 2001) ، والديدان وراثيا مع التعبير Aβ محرض ونادرا ما يكون الودائع اميلويد والنمط الظاهري الشلل يظهر مستقلة عن ترسب الأميلويد (دريك وآخرون. 2003). نتائجنا تتفق مع الرأي القائل بأن من السمية الحادة الناجمة عن النتائج التعبير Aβ من تراكم Aβ oligomeric القابلة للذوبان ، وليس ترسب الأميلويد.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكواشف </td><td> Quantity/2L </td><td> الشركة / كتالوج # </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 6G </td><td> سيغما الدريخ / S9888 </td><td></td></tr><tr><td> آغار </td><td> 40G </td><td> سيغما الدريخ / A7002 </td><td></td></tr><tr><td> الببتون مادة تنشأ عن البروتينات </td><td> 5G </td><td> سيغما الدريخ / P0556 </td><td></td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 2L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M CaCl 2 </td><td> 2mL </td><td></td><td> 147.02mg/mL في DDH 2 O </td></tr><tr><td> اليوراسيل </td><td> 2mL </td><td></td><td> 2mg/mL في DDH 2 O </td></tr><tr><td> كولسترول </td><td> 2mL </td><td></td><td> 5mg/mL في الإيثانول (لا الأوتوكلاف) </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 2mL </td><td></td><td> 246.5mg/mL في DDH 2 O </td></tr><tr><td> 1M KPO 4 </td><td> 50mL </td><td></td><td> 98mg KH 2 PO 4. مل ، 48mg K2HPO4/mL في DDH 2 O ، ودرجة الحموضة </td></tr><tr><td> قارورة مخروطي </td><td></td><td> VWR </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying &beta;-amyloid toxicity using a transgenic c. elegans model

ويعتقد عموما تراكم الببتيد β اميلويد (Aβ) ليكون أساسيا في تحريض مرض الزهايمر ، ولكن الآلية ذات الصلة (ق) من السمية لا تزال غير واضحة. يترسب ايضا Aβ عضليا في العضل الهيئة إدراج ، وهو عضلي حاد الإنسان. يمكن أن تكون الدودة الخيطية ايليجانس انواع معينة درس مكثف المهندسة transgenically Aβ للتعبير عن الإنسان. بالاعتماد على الأنسجة أو توقيت التعبير Aβ ، يمكن الديدان المعدلة وراثيا والظواهر التي يمكن قياسها بسهولة بمثابة قراءة للخروج من سمية Aβ. على سبيل المثال ، والديدان وراثيا مع التعبير Aβ عموم العصبية جود عيوب هو التعلم النقابي (دوسانيه وآخرون 2009) ، في حين الديدان المعدلة وراثيا مع التأسيسية التعبير محددة العضلات تظهر تدريجيا ، والسن التي تعتمد على النمط الظاهري الشلل (لينك ، 1995 ؛ كوهين وآخرون 2006). جيم واحدة مفيدة بشكل خاص ايليجانس نموذج توظف طفرة حساسة للحرارة في mRNA نظام مراقبة لدرجات الحرارة مهندس محرض التعبير العضلات من التحوير Aβ ، مما أدى إلى النمط الظاهري الشلل استنساخه على التروس درجات الحرارة (وصلة وآخرون 2003). العلاجات التي سمية Aβ العداد في هذا النموذج [على سبيل المثال ، التعبير عن التحوير واقية (حسن وآخرون 2009) أو التعرض لالجنكه بيلوبا مقتطفات (وو وآخرون 2006)] بتكاثر تغيير معدل الشلل الناجم عن الحرارة التروس هذه المعدلة وراثيا الديدان. هنا نحن لدينا وصف بروتوكول لقياس نسبة الشلل في هذا جيم المعدلة وراثيا ايليجانس النموذج ، مع إيلاء اهتمام خاص للمتغيرات التجريبية التي يمكن أن تؤثر على هذا القياس.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Î²-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model at JoVE.com

Assaying &#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

الدودة الخيطية درس مكثف<em&gt; انواع معينة ايليجانس</emيمكن&gt; المهندسة transgenically للتعبير عن الإنسان β اميلويد ببتيد (Aβ). المستحث في التعبير عن Aβ<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; العضلات يؤدي إلى السريع ، والنمط الظاهري استنساخه الشلل التي يمكن استخدامها لرصد العلاجات التي تعدل سمية Aβ.

يعاير β اميلويد السمية باستخدام المعدلة وراثيا C. ايليجانس النموذجي

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

assaying-amyloid-toxicity-using-a-transgenic-c-elegans-model

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

25.6K Views.  University of Colorado. الدودة الخيطية درس مكثف انواع معينة ايليجانس المهندسة transgenically للتعبير عن الإنسان β اميلويد ببتيد (Aβ). المستحث في التعبير عن Aβ C. ايليجانس العضلات يؤدي إلى السريع ، والنمط الظاهري استنساخه الشلل التي يمكن استخدامها لرصد العلاجات التي تعدل سم...

Video: Assaying β-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

جيم ايليجانس Butanone التعلم الإيجابي ، قصيرة الأجل وطويلة الأجل فحوصات الذاكرة الترابطية

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

في Axotomy الليزر المجراة في C. ايليجانس

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

الآلي الكمي من الإسفار متشابك في<em&gt; C. ايليجانس</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. ايليجانس تتبع وقياس السلوكية

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A قراءات الجزيئية من التكيف على المدى الطويل في الشم<em&gt; C. ايليجانس</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

يعاير الحمض النووي من التلف في الخلايا العصبية قرن آمون باستخدام مقايسة المذنب

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; النظام النموذجي للدراسات Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

في فيفو التصوير من داور محددة العصبية في إعادة عرض C. ايليجانس

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

يعاير β اميلويد السمية باستخدام المعدلة وراثيا C. ايليجانس النموذجي

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

جيم ايليجانس Butanone التعلم الإيجابي ، قصيرة الأجل وطويلة الأجل فحوصات الذاكرة الترابطية

في Axotomy الليزر المجراة في C. ايليجانس

الآلي الكمي من الإسفار متشابك في

C. ايليجانس تتبع وقياس السلوكية

A قراءات الجزيئية من التكيف على المدى الطويل في الشم

يعاير الحمض النووي من التلف في الخلايا العصبية قرن آمون باستخدام مقايسة المذنب

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

A

تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي

في فيفو التصوير من داور محددة العصبية في إعادة عرض C. ايليجانس