Morhardt Laboratuvarı'nda, mesane gelişimini ve işlevini incelemek için zebra balığını bir hayvan modeli olarak kullanıyoruz. Zebra balıklarında dolan ve boşalan fonksiyonel bir idrar kesesi belirledik. Zebra balığı küçük olsa da, mekansal transkriptomik teknikleri ve omurgalı mesanesi hakkındaki anlayışımızı ekonomik olarak kullanmak için boyutundan yararlanmaya çalıştık.
Uzamsal transkriptomik teknikler, reaktifler ve ekipman optimize edilmezse hızla pahalı hale gelebilir. Bu protokol, zebra balığı kullanarak bunu başarmak için kanıtlanmış bir teknik sağlar ve teknolojinin bir sonucu olarak ortaya çıkabilecek beklenen sonuçlara ve sorunların azaltılmasına ilişkin içgörüler sağlar. Pahalı mekansal transkriptomik teknolojilerin ekonomik kullanımının yanı sıra, bu çalışma, toplu etkileri en aza indirirken, birkaç yaş boyunca esasen tüm organların büyük ölçekli mekansal transkriptomik analizlerini yapmamıza izin verdi.
Başlamak için, kriyostatı 22 santigrat dereceye soğutun ve gerekli tüm öğeleri toplayın. Numune hizalaması için tek kullanımlık bir plastik kalıp hazırlayın. Taban kalıbının içine bir parça laboratuvar bandı yerleştirin ve referans noktası olarak kalıcı bir işaretleyici ile üzerine düz bir çizgi çizin.
Kriyoseksiyon sırasında uygun numune oryantasyonunu sağlamak için temel kalıbın içini işaretleyin. Dondurma ortamı şişesinin ağzını astarladıktan sonra, gerekli miktarı taban kalıbının bir köşesine dağıtın. Ortamı eşit şekilde dağıtmak için taban kalıbını yavaşça eğin.
Şimdi, dondurma ortamlı taban kalıbını bir buz banyosuna yerleştirin ve ortamı soğutmak için en az 10 dakika inkübe edin. Ardından, davlumbazın altındaki bir buz kovasında bir parça kuru buza bir parça %100 etanol ekleyin. Tek kullanımlık alüminyum tabağı veya tekneyi buz banyosuna yerleştirin ve kovayı beş ila 10 dakika kapatın.
Ötenazi yapılmış balıkları 10 dakika boyunca dört santigrat derece suya batırdıktan sonra toplayın. İnce uçlu forseps kullanarak, balığı çıkarmak için kuyruk yüzgecini kavrayın ve kurutmak için emici, tüy bırakmayan bir mendile hafifçe bastırın. Hazırlanan taban kalıbını 10x büyütmeli bir stereo mikroskop altına yerleştirin.
Numuneyi kalıba referans noktası boyunca doğru yönde yerleştirin. Numuneyi başka bir ince dondurucu ortam tabakası ile nazikçe örtün. Balıkları taban kalıbının içindeki işaretli çizgilere tam olarak hizalamak için anatomik bir referans noktası kullanın ve kabarcıklardan kaçınarak ince uçlu forseps kullanarak yönü ayarlayın.
Numunenin altındaki taban kalıbının altına, yerel olarak donana kadar bir parça kuru buz uygulayın. Tamamen dondurmadan önce numunenin yanlış hizalanmasını önlemek için düz bir yatay düzlemi koruyun. Şimdi numuneyle birlikte taban kalıbını kuru buz ve etanol banyosundaki alüminyum tekneye veya tabağa yerleştirin.
Teknenin yüzeyde yüzmeye devam ettiğinden ve taban kalıbının kuru kaldığından emin olun. Banyoyu örtün ve numunelerin 10 dakika donmasına izin verin. Ardından, donmuş taban kalıbını folyoya sarın ve bölümlere ayırmaya hazır olana kadar 80 santigrat derecede bir dondurucuda saklayın.
Donmuş baz kalıbını kriyoseksiyon için önceden soğutulmuş kriyostata getirin ve kriyostat odasına yerleştirin. Uzamsal görüntüleme slaytını depodan çıkardıktan sonra, önceden soğutulmuş bir slayt tutucusuna yerleştirin. Uzamsal görüntüleme slaytı ile birlikte slayt tutucuyu, kesit toplamaya hazır olana kadar 22 santigrat derece kriyostat odasında saklayın.
Şimdi, donmuş numuneyi taban kalıbından çıkarın ve kesme yüzeyinin mikrotom bıçağına baktığından emin olarak taze dondurma ortamına sahip bir aynaya yerleştirin. Ardından kriyostata taze bir ince mikrotom bıçağı yerleştirin. Kalıbı bıçağa hizaladıktan sonra, ilgilenilen bölgeyi önerilen 20 ila 50 mikrometre kalınlığında kesin.
Doğru numune oryantasyonu için kalıbın içindeki işaretlerin donmuş bloğa aktarıldığından emin olun. Kırpma sırasında kalıbı, kesme yüzeyi dondurma ortamındaki referans işaretlerine paralel kalacak şekilde ayarlayın. Donmuş bloktan kesitler dilimleyin ve bunları standart pozitif yüklü bir mikroskop lamı üzerine toplayın.
Kırpmanın tamamlandığını doğrulamak için bölümleri parlak alan mikroskobu altında kontrol edin. Ardından, uzamsal görüntüleme slaytını kriyostat odasından çıkarın ve slayt tutucunun içinde tutarken dört santigrat derecelik bir buz banyosuna yerleştirin. Önerilen 10 ila 14 mikrometre kalınlığında kriyoseksiyona başlayın.
İlgilenilen bölgeye ulaşılana kadar bölümleri pozitif yüklü slaytlar üzerinde toplayın. Şimdi tek hücreli uzamsal görüntüleme slaytını buz banyosundan alın ve slaytı tutucudan çıkarın. Yuvarlanmayı önlemek için ince uçlu bir boya fırçası kullanarak bölümleri sıra sıra toplayın.
Ardından, bir boya fırçasının arka tarafını kullanarak boş dondurma ortamının bir köşesini bıçak tablasına bastırın. Sürgünün üst kısmını pivot noktası olarak kullanın ve kaldırmadan önce üç saniye yapışmasını sağlamak için sürgüyü yavaşça bölümün üzerine indirin. Slayttaki alanı en üst düzeye çıkarmak için seri bölümleri birbirine paralel hizalayın.
İlgilenilen bölgeden bölümleri topladıktan sonra, sürgüyü tekrar sürgü tutucusuna yerleştirin. Daha fazla numuneye ihtiyaç duyulmuyorsa, slaytı analizden önce iki haftaya kadar 80 santigrat derecede saklayın. İlgilenilen bölgeden önce ve sonra bölümleri standart bir pozitif yüklü mikroskop lamına toplayın ve analize devam etmeden önce numune hizalamasını ve kesit kalitesini değerlendirmek için hematoksilen ve eozin boyama yapın.
Çoklu kesit hizalaması, aynı kesimdeki bölümler arasındaki yapılar karşılaştırılarak doğrulandı. Gömme ve toplama adımlarında yapılan ayarlamalar, uzamsal bir transkriptomik slaytın görüntüleme alanına daha fazla sayıda bölümün sığmasını sağladı. Uzaysal transkriptomik sinyal kalitesi, düşük sinyal karmaşıklığı nedeniyle doku bölgelerinde yüksek, ancak boş slayt alanlarında daha düşüktü.
