Özel ekipman ihtiyacını ortadan kaldırarak, hücre içi sialillenmiş glikokonjugatları yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip görselleştirmek için basit bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, çeşitli patolojik bağlamlarda biyosentez, kaçakçılık ve geri dönüşümün incelenmesini kolaylaştırır. Bunu başarmak için metabolik etiketlemeyi, tıklama kimyasını ve genleşme mikroskobunu birleştiriyoruz.
STED ve STORM gibi süper çözünürlüklü mikroskopi teknikleri, bilim adamlarının kırınım bariyerini aşmasına izin verir, ancak pahalı ekipman gerektirirler. Son zamanlarda, genleşme mikroskobu, numuneyi fiziksel olarak büyüterek çözünürlüğü artıran daha erişilebilir bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Bu yöntem herhangi bir rutin tam kaynak mikroskobu ile kullanılabilir.
Maliyetli, zaman alıcı, erişimi zor ve kapsamlı optimizasyon gerektiren süper çözünürlüklü mikroskoplar gerektirmez. Bu nedenle, bu yöntem çoğu laboratuvara kolayca aktarılabilir. Başlamak için, hazırlanan hücrelere 500 mikromolar N-azidoasetilmannozamin ile takviye edilmiş bir mililitre ortam ekleyin ve% 5 karbondioksit atmosferi altında 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin.
Ardından, numuneleri bir mililitre PBS ile yıkayın. 500 mikrolitre %5'lik paraformaldehit kullanarak, hücreleri her bir kapak kızağına sabitleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika dinlenmeye bırakın. Ardından, kapaklı opak bir kutu kullanarak özel bir nem odası hazırlayın.
Altına ıslak bir parça kurutma kağıdı yerleştirin, ardından üstüne bir kat parafilm koyun. Kapak fişlerini, hücreler yukarı bakacak şekilde parafilm üzerine yerleştirin. Hücre geçirgenliği için, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS'ye 200 mikrolitre% 0.5 Triton X-100 ekleyin.
Ardından, hücreleri 200 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Verilen bileşenler kullanılarak tasarlanmış Azid ile modifiye edilmiş sialillenmiş glikanları etiketlemek için bir CuAAC reaksiyon tamponu hazırlayın. Reaksiyonu başlatmak için, her bir kapak kızağına 200 mikrolitre CuAAC tamponu ekleyin ve numuneyi iyice kapatın.
Ardından, reaksiyonu durdurmak ve fazla prob ve reaktifleri çıkarmak için kapak fişlerini 200 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Numuneleri 200 mikrolitre BSA bloke edici tamponda dört santigrat derecede bir saat inkübe edin. Kapak fişlerine birincil antikor içeren çözeltiden 70 mikrolitre ekleyin ve ışıktan korunarak dört santigrat derecede bir saat inkübe edin.
Daha sonra, her bir örtü kaymasına 100 mikrolitre floresan ikincil antikor ekleyin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Kapak fişlerini PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, kapak fişlerini altı oyuklu bir plakaya aktarın ve numuneleri birkaç gün boyunca ışıktan koruyarak dört santigrat derecede iki mililitre PBS'de saklayın. Başlamak için, immünostain hücrelerini, oda sıcaklığında bir saat boyunca mekanik bir çalkalayıcı üzerinde PBS'de mililitre başına 3.2 miligram konsantrasyonda n-Akriloylsüksinimid ile inkübe edin.
Ardından, numuneleri bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Şimdi, bir parça parafilm üzerine 70 mikrolitrelik bir monomer çözeltisi damlatın. 1.4 mikrolitre %10 N, N, N'N'Tetrametiletilendiamin ve %10 amonyum persülfat ekleyin, ardından bunları damlaya karıştırın.
Kapak fişini, hücreler aşağı bakacak şekilde çözeltinin üzerine hızlı bir şekilde yerleştirin. Çözeltinin nemli bir odada oda sıcaklığında bir saat polimerize olmasına izin verin. Daha sonra, hidrojele bir mililitre sindirim tamponu ekleyin ve sindirimin mekanik bir çalkalayıcı üzerinde 37 santigrat derecede üç saat ilerlemesine izin verin.
Sindirim tamponunu çıkardıktan sonra, jeli iki mililitre deiyonize su ile üç kez yıkayın. Şimdi, hidrojeli üç mililitre deiyonize suda iki saat boyunca genleşmeye bırakın ve suyu her 30 dakikada bir değiştirin. Başlamak için mikroskobu açın ve ışık kaynaklarının ısındığından emin olun.
Ardından, Biyogörüntüleme Edinme Yazılımını açın. Kanalları oluşturmak için, floroforlara karşılık gelen lazer uyarma dalga boylarını seçin ve lazerleri buna göre etkinleştirin. 1,4 sayısal diyafram açıklığına sahip 63x yağa daldırma objektifi veya eşdeğeri gibi uygun bir objektif lensi seçin.
Şimdi, 32 milimetre çapında bir kapak kızağını mikroskoba uyarlanmış bir tutucuya yerleştirin ve sabitleyin. İmmünostain hücre örneğini, hücreler aşağı bakacak şekilde 32 milimetrelik kapak kızağına yerleştirin ve örneğin kurumasını önlemek için bir damla deiyonize su ekleyin. Ardından, tutucuyu kapak kaymalı olarak objektifin üzerindeki mikroskop tablasına yerleştirin.
Genişletme sonrası görüntüleme için, hidrojeli kapak kızağına yerleştirin ve bir döşeme taraması yapın. İlgilenilen bir alanı bulmak ve odaklamak için Parlak Alan veya Düşük Lazer Yoğunluklu Floresan modunu kullanın. Ardından, istenen gözlemi elde etmek için tarama hızı, ortalama sayı, yön, tarama modu, yöntem ve iğne deliği boyutu gibi görüntü elde etme parametrelerini ayarlayın.
Şimdi, Canlı Floresan modunu kullanarak yazılımdaki hücreleri görselleştirin. Lazer gücünü kademeli olarak artırın ve aşırı gürültü oluşturmadan sinyali yükseltmek için dedektör kazancını ve ofsetini ayarlayın, böylece aşırı maruz kalmadan net floresan görselleştirmesi sağlayın. Son olarak, görüntü alımını gerçekleştirin ve verileri istenen formatta kaydedin, böylece ileride başvurmak üzere uygun meta verileri eklediğinizden emin olun.
Alım tamamlandıktan sonra, cımbız kullanarak transferi kolaylaştırmak için az miktarda deiyonize su ekleyin ve numuneyi altı oyuklu plakaya geri aktarın. Ortalama çekirdek Feret çapı, genişlemeden önce 17.7 mikrometreden genişlemeden sonra 70.3 mikrometreye yükseldi ve bu da dört genişleme faktörünü gösterdi. Genleşme mikroskobundan önceki fibroblast işaretleme paterni, Golgi aygıtındaki hücre altı ayrıntıları gösteren belirgin kırmızı ve yeşil floresan gösterdi, ancak sınırlı çözünürlükle, ölüm içi analizi önledi.
Genişleme mikroskobundan sonra, fibroblast hücreleri içinde görülebilen daha karmaşık yeşil ve kırmızı veziküller ile hücre altı yapıların önemli ölçüde artmış uzamsal çözünürlüğü gözlendi.
