使用 Click 化学和扩增显微镜观察细胞内唾液酸化

我们提出了一种简单的方案，用于以高空间分辨率可视化细胞内唾液酸化糖缀合物，无需专用设备。这种方法有助于研究各种病理背景下的生物合成、运输和回收。为了实现这一目标，我们结合了代谢标记、点击化学和扩增显微镜。

STED 和 STORM 等超分辨率显微镜技术使科学家能够超越衍射障碍，但它们需要昂贵的设备。最近，膨胀显微镜已成为一种更容易获得的替代方案，它通过物理放大样品来提高分辨率。该方法可用于任何常规全资源显微镜。

它不需要超分辨率显微镜，因为超分辨率显微镜成本高昂、耗时、难以接近且需要大量优化。因此，这种方法很容易转移到大多数实验室。首先，向制备的细胞中加入 1 毫升补充有 500 微摩尔 N-叠氮乙酰甘露糖胺的培养基，并在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳气氛下孵育 24 小时。

然后，用 1 毫升 PBS 洗涤样品。使用 500 μL 5% 多聚甲醛，将细胞固定在每个盖玻片上，并在室温下静置 15 分钟。接下来，使用带盖的不透明盒子准备一个定制的潮湿室。

在底部放一张湿的吸墨纸，然后在上面铺上一层封口膜。将盖玻片放在封口膜上，使细胞朝上。对于细胞透化，在室温下加入 200 μL 0.5%Triton X-100 的 PBS 溶液 15 分钟。

然后，用 200 μL PBS 洗涤细胞 3 次。制备 CuAAC 反应缓冲液，以标记使用给定组分设计的叠氮化物修饰的唾液酸化聚糖。为了引发反应，向每个盖玻片中加入 200 微升 CuAAC 缓冲液，并彻底覆盖样品。

然后，用 200 μL PBS 清洗盖玻片 3 次，以停止反应并去除多余的探针和试剂。将样品在 4 摄氏度下在 200 μL BSA 封闭缓冲液中孵育 1 小时。将 70 μL 含有一抗的溶液添加到盖玻片中，并在 4 摄氏度下避光孵育 1 小时。

然后，向每个盖玻片中加入 100 μL 荧光二抗，并在室温下避光孵育 1 小时。用 PBS 清洗盖玻片 3 次后，将盖玻片转移到六孔板中，并将样品在 4 摄氏度的 2 毫升 PBS 中避光储存几天。首先，将免疫染色细胞与浓度为 3.2 毫克/毫升的 n-丙烯酰琥珀酰亚胺的 PBS 溶液在机械摇床上在室温下孵育 1 小时。

然后，用 1 毫升 PBS 洗涤样品 3 次。现在，将 70 微升单体溶液滴在一块封口膜上。加入 1.4 微升 10%N、N、N'N'四甲基乙二胺和 10% 过硫酸铵，然后将它们混合到液滴中。

快速将盖玻片放在溶液上，使细胞朝下。让溶液在室温下在潮湿室中聚合 1 小时。接下来，向水凝胶中加入 1 毫升消化缓冲液，并在机械摇床上在 37 摄氏度下进行消化 3 小时。

去除消化缓冲液后，用 2 毫升去离子水洗涤凝胶 3 次。现在，让水凝胶在 3 毫升去离子水中膨胀 2 小时，每 30 分钟换一次水。首先，打开显微镜并确保光源已预热。

然后，打开 Bioimaging Acquisition Software。要创建通道，请选择与荧光团相对应的激光激发波长并相应地激活激光器。选择合适的物镜，例如具有 1.4 数值孔径的 63 倍油浸物镜或同等物镜。

现在，将直径为 32 毫米的盖玻片放入并固定在适合显微镜的支架中。将细胞朝下的免疫染色细胞样品放在 32 毫米盖玻片上，并加入一滴去离子水以防止样品变干。然后，将带有盖玻片的支架放在物镜上方的显微镜载物台上。

对于扩增后成像，将水凝胶放在盖玻片上并进行平铺扫描。使用明场或低激光强度荧光模式定位感兴趣区域并将其聚焦。然后，设置图像采集参数，如扫描速度、平均数、方向、扫描模式、方法和针孔大小，以实现所需的观察。

现在，使用实时荧光模式在软件中可视化细胞。逐渐增加激光功率并调整检测器增益和偏移以放大信号，而不会引入过多的噪声，确保清晰的荧光可视化而不会过度曝光。最后，执行图像采集并以所需格式保存数据，确保包含适当的元数据以供将来参考。

采集完成后，加入少量去离子水以方便使用镊子转移，然后将样品转移回六孔板中。平均原子核 Feret 直径从膨胀前的 17.7 微米增加到膨胀后的 70.3 微米，表明膨胀因子为 4。扩增显微镜检查前的成纤维细胞标记模式显示明显的红色和绿色荧光，表明高尔基体中的亚细胞细节，但分辨率有限，无法进行死亡分析。

扩增显微镜检查后，观察到亚细胞结构的空间分辨率显著提高，成纤维细胞内可见更复杂的绿色和红色囊泡。