Araştırmamız, invaziv mantar enfeksiyonları için kullanıma hazır bir CAR hücresel tedavisi geliştirmeye odaklanmaktadır. Optimal terapötik sonuçlar elde etmek için en iyi hedefleri, CAR tasarımlarını ve bağışıklık hücreleri kombinasyonunu belirlemeyi amaçlıyoruz. Kendi çalışmalarımız da dahil olmak üzere son gelişmeler, Aspergillus fumigatus'u hedef alan CAR T-hücresi tedavilerinin geliştirilmesine odaklanmıştır.
Bu tasarlanmış hücreler, mantar yükünü önemli ölçüde azaltarak, antifungal bağışıklığı kontrol ederek ve genel sağkalımı iyileştirerek klinik öncesi modellerde umut verici sonuçlar göstermiştir. Şu anda, bu alandaki araştırmaların çoğu, viral vektörler veya uyuyan güzel transpozon sistemi kullanılarak çok sınırlı bir hedef kümesine özgü CAR T-hücreleri üretmeye odaklanmıştır. Ana zorluklar, optimal mantar hedeflerinin belirlenmesini ve klinik uygulamalar için hem etkili hem de ölçeklenebilir kullanıma hazır bir hücresel ürün üretilmesini içerir.
Bu protokolle, viral olmayan CAR-NK hücreleri üretmek için uygun maliyetli ve ölçeklenebilir yöntemlere olan ihtiyacı ele alıyoruz. Mantar enfeksiyonları için kullanıma hazır CAR-NK hücresel tedavisine yönelik temel bir adım sağlayarak, yeni antifungal hedeflerin taranması için erişilebilir bir yaklaşım sağlar. Başlamak için, NK-92 hücrelerini net bir arka plandaki kümeler için mikroskop altında kontrol edin, her koşul için oyuk başına 2 mililitre hücre kültürü ortamı ekleyin altı oyuklu bir plakaya ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.
8 kez 10'u 6 NK-92 hücresinin gücüne 15 mililitrelik konik tabanlı bir tüpe aktarın ve tüpü 3 hızlanma ve yavaşlama ile beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini içeren tüpü 15 mililitreye kadar önceden ısıtılmış PBS ile doldurun ve tekrar santrifüjleyin. Santrifüjleme sırasında, 8 mikrogram Af-CAR plazmit DNA'sını ve 4 mikrogram SB100X mini dairesini bir reaksiyon tüpüne pipetleyin ve ikinci tüp DNA'sını sahte bir kontrol olarak hizmet etmek için serbest tutun.
Transfeksiyon sistemi için, ilk tüpe 3 mililitre elektrolitik tampon ekleyin ve pipet istasyonuna yerleştirin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı nazikçe atın ve hücre peletini 200 mikrolitre yeniden süspansiyon tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra iki reaksiyon tüpünün her birine 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve hafifçe karıştırın.
Transfeksiyon sistemi pipetini kullanarak DNA hücresi karışımını ilk reaksiyon tüpünden pipetleyin, transfeksiyon pipetini pipet istasyonundaki tüpe dikey olarak yerleştirin. Nabzı başlatmak için başlat düğmesine basmadan önce ilk darbeyi 1.650 volta ve nabız süresini 20 milisaniyeye ayarlayın. İlk darbeden sonra, ikinci darbeyi 500 volta ve darbe süresini 100 milisaniyeye ayarlayın ve ikinci darbeyi başlatın.
İkinci darbe tamamlandığında, pipeti pipet istasyonundan yavaşça çıkarın. Hücreleri hemen 2 mililitre önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamı içeren hazırlanmış kültür plakasının bir oyuğuna aktarın ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı dairesel hareketlerle yavaşça hareket ettirin. Plakayı% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
30 dakikalık inkübasyondan sonra, mililitre başına 150 uluslararası birimlik bir nihai konsantrasyonda kuyucuklara interlökin-2 ekleyin. Başlamak için, NK-92 hücrelerini istenen plazmid ile transfekte edin. Hücreleri 15 mililitrelik konik bir alt tüpe aktarın.
Daha sonra hücreleri santrifüjleyin ve tamponu kullanarak 1 ila 2 kez 10 ila 100 mikrolitre başına 6 hücre gücüne kadar seyreltin. 6 hücrenin gücüne 1 çarpı 10'da bir mikrolitre anti EGFR-T biyotin ekleyin ve çözeltinin eşit şekilde dağılmasını sağlamak için hafifçe karıştırın. Tüpü 4 santigrat derecede 25 dakika inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, tüpü 10 mililitreye kadar tamponla doldurun. Daha sonra, tüpü 3 hızlanma ve yavaşlama ile beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin ve santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın. Daha sonra 8 mikrolitre soğuk tampon ve ardından 1 çarpı 10'da iki mikrolitre anti-biyotin manyetik boncuk ekleyin, 6 hücrenin gücüne.
Tüpü 4 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Hücreleri yıkamak için tüpü 10 mililitreye kadar tampon ve santrifüj ile doldurun. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri 500 mikrolitre tamponda yeniden süspanse edin.
Maksimum mıknatısın içine bir LS sütunu yerleştirin ve 3 mililitre tamponla yıkayın. Tampon sütundan tamamen geçtikten sonra hücre süspansiyonunu ekleyin. Sütunu yıkadıktan sonra, mıknatıstan çıkarın ve temiz bir 15 mililitrelik konik alt boruya yerleştirin.
Kolona 5 mililitre tampon ekleyin ve EGF-R pozitif hücrelerini mümkün olan en kısa sürede temizlemek için pistonu kullanın. Geri kazanım sonrası transfeksiyon verimliliği %10 ila 20'ye ulaştı ve maksimum zenginleştirme Af-CAR-NK-92 hücre saflığını %95'in üzerine çıkardı Başlamak için, manyetik ile aktive edilmiş hücre sıralama tekniğini kullanarak zenginleştirilmiş transgen eksprese eden NK-92 hücreleri elde edin. Daha sonra, ortamda mililitre başına 5 conidia kuvvetinde 2.5 kez 10 konsantrasyonda bir Aspergillus fumigatus conidia süspansiyonu hazırlayın.
100 mikrolitre conidia süspansiyonunu 96 oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna dağıtın ve plakayı 16 saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. İkinci günde, sahte ve plazmid transfekte edilmiş NK-92 hücrelerini ortamla iki kez yıkayın ve mantarı içeren plakanın oyuğu başına 100 mikrolitre ortamdaki 4 NK-92 hücresinin gücüne 5 kez 10 ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir karbondioksit inkübatörde en az 6 saat inkübe edin.
Plakayı beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjledikten sonra, dibe dokunmadan her oyuktan 100 mikrolitre süpernatan hasat edin. Son olarak, ELISA'yı gerçekleştirmek için süpernatanları reaksiyon tüplerine aktarın. Af-CAR-NK-92 hücreleri, aspergillus fumigatus germ tüpleri ile ko-kültür sırasında sahte NK-92 hücrelerine kıyasla önemli ölçüde daha yüksek interferon gama sekresyonu gösterdi.
