Bu protokol, EcoHIV enfeksiyonunun Tmem119-EGFP fareleri ile kombinasyonunun, HIV ile ilişkili nörobilişsel bozuklukların kemirgen modellerinde mikroglial değişiklikleri ve viral rezervuarları araştırmak için nasıl değerli bir biyolojik sistem sunduğunu açıklar. Kombine antiretroviral tedavi, HIV ile yaşayan insanların yaşam kalitesini önemli ölçüde iyileştirmiştir. HIV'in merkezi sinir sistemini nasıl etkilediğini anlamak için güvenilir ve uygulanabilir bir HIV modeli gereklidir.
Daha önce, nörokognitif bozukluk ve sinaptik disfonksiyonu araştırmak için sıçan modelinde kimerik HIV, eşlemede EcoHIV kullanan yeni bir biyolojik sistem geliştirilmiştir. EcoHIV'in nöroanatomik dağılımını, özellikle de beyindeki çeşitli hücre tiplerindeki diferansiyel ekspresyonunu açıklığa kavuşturmada önemli bir zorluk devam etmektedir. Bu çalışmada, mScarlet floresan etiketlemeli EcoHIV, mikroglia'nın viral ekspresyondan ve beyindeki HIV rezervuarından sorumlu ana hücre tipi olup olmadığını belirlemek için modifiye edildi ve Tmem119-EGFP knock-in farelere retro-orbital olarak enjekte edildi.
Başlamak için, ayrışmış fetal sıçan beyin hücrelerini, bir mililitre DMEM-F12 ve% 10 FBS içeren cam ekler içeren poli-L-lizin önceden kaplanmış 12 oyuklu bir plakaya aktarın. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin. Ertesi gün, ortamı B27 ile takviye edilmiş bir Nörobazal ortam ile değiştirin ve hücreleri üç hafta boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kültürlemeye devam edin.
Daha sonra beyin hücre kültürüne 60 mikrolitre EcoHIV-mScarlet ekleyin ve altı gün boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Spesifik primer antikorlar kullanarak enfekte beyin hücreleri üzerinde immün boyama yapın ve bunları 40x objektif altında konfokal bir mikroskopta görüntüleyin.
Mikroglia, mScarlet'in CD11b/c ve Iba1 belirteçleri ile kolokalizasyonu ile kanıtlandığı gibi, sıçan beyin hücresi kültürlerinde ana enfekte hücre tipi olarak tanımlandı. Başlamak için, kafası kesilmiş yetişkin bir farenin kafa derisini açın ve beyin dokusunu beş mililitre sterilize HBSS içeren başka bir Petri kabına aktarın. Meninksleri soyun ve frontal korteksi iki mililitre HBSS'ye aktarın.
Daha sonra, karışıma 20 mikrolitre% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin, tüpü birkaç dakikada bir döndürün. Ayrışmış hücreleri, 10 mililitre DMEM-F12 ortamı ve% 10 FBS içeren poli-L-lizin önceden kaplanmış 75 santimetre karelik bir şişeye aktarın.
Hücreleri, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörinde% 90 birleşmeye ulaşana kadar kültür hücreleri. Daha sonra, beyin hücrelerini iki mililitre% 0.25 tripsin-EDTA ile sindirin. Sindirilmiş beyin hücrelerini, %80 birleşme noktasına ulaşana kadar beş mililitre DMEM-F12 büyüme ortamı içeren 35 milimetrelik bir cam alt tabağa alt kültürleyin.
Daha sonra fare glial hücrelerine sekiz mikrolitre EcoHIV-mScarlet ekleyin ve iki gün boyunca inkübe edin. Yetişkin fare primer glial hücreleri, iki günlük tedaviden sonra EcoHIV-mScarlet ile başarılı bir şekilde enfekte edildi. Başlamak için, anestezi uygulanmış Tmem119-EGFP fareyi yanal pozisyonda sabitleyin.
EcoHIV-mScarlet'i buz üzerinde çözdürün. Viral solüsyonu 33 gauge künt iğne ile göz içi enjektör şırıngasına doldurun. Fareyi, başı sola bakacak şekilde sağ yanal yaslanacak şekilde yerleştirin.
Göz çevresi etrafındaki enjeksiyon alanını belirleyin. İğneyi yavaşça ve nazikçe gözün medial kantusuna sokun. Ardından iğneyi göz küresinin arkasındaki damarlara ilerletin.
Retro-orbital sinüse 6,5 mikrolitre EcoHIV-mScarlet enjekte edin. Enjeksiyondan sonra iğneyi dikkatlice çıkarın. Anestezi uygulanmış fareyi kimyasal bir davlumbazın içine sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
Cildi torasik orta hat boyunca açın. Sonra diyaframı ayırın ve göğsü makasla açın. Şimdi sol ventriküle 22 gauge bir buçuk iğne sokun.
Sağ atriyumu makasla açın. Sağ atriyuma 50 mililitre önceden soğutulmuş 100 milimolar PBS ile perfüz, ardından 100 mililitre önceden soğutulmuş %4 paraformaldehit ile perfüze edin. Fare beyninin tamamını çıkarın.
Beyni %4 paraformaldehitte sabitledikten sonra, Vibratomun metal platformu üzerinde doku yapıştırıcısı kullanarak beyin dokusunu sabitleyin. Karbon çelik bıçaklarla 50 mikrometre kalınlığında koronal bölümler kesin. Ardından, beyin dilimlerini bir fırça kullanarak cam slaytların üzerine yerleştirin.
Hemen her bölüme 0,1 mililitre solmaya karşı önleyici montaj ortamı ekleyin. Beyin bölümlerinin üzerine 22 x 50 milimetrelik bir örtü kaydırın ve Superfrost slaytlarını bir gün karanlıkta kurutun. Ertesi gün, ilgilenilen beyin bölgesinin çok kanallı görüntülerini elde etmek için 488 nanometre ve 594 nanometre dalga boylarına sahip konfokal bir mikroskop kullanın.
EcoHIV-mScarlet sinyalleri öncelikle Tmem119-EGFP fare beyninde EGFP ile etiketlenmiş mikroglial hücrelerde gözlendi. EcoHIV-mScarlet ile tedavi edilen kültürlenmiş sıçan beyin hücrelerinde önemli bir nöronal enfeksiyon tespit edilmedi.
