Bu protokol, çok çeşitli hidrofobik biyoaktif molekülleri istikrarlı bir şekilde içeren nanoölçekli parçacıkları, yani nanodiskleri formüle etmek için yararlı olan pratik bilgi sağlar. Bu yöntemin birçok pratik uygulaması vardır.
Aksi takdirde çözünmeyen biyoaktif bileşiklere sulu çözünürlük sağlama yeteneği, ilaç dağıtım uygulamalarında nanodisklerin kullanılmasına izin verir. Açıklanan yöntem basittir. Tarif edilen ölçekte, beş miligram fosfolipit, iki miligram iskele proteini üzerinde çalışmalar yapılması tercih edilir, böylece nanodisklerin oluşumu görsel inceleme ile kolayca izlenir.
Prosedürü gösterenler, Ryan laboratuvarındaki lisans öğrencisi araştırmacılar Michael Karo ve Matthew Swackhammer olacak. Bir fosfolipid alikotu hazırlamak için, beş miligram DMPC'yi tartın ve bir cam test tüpüne aktarın. Fosfolipidi, üç ila bir oranında 300 mikrolitre kloroform ve 100 mikrolitre metanol ekleyerek çözün.
Cam test tüpünü 10 ila 15 dakika boyunca yumuşak bir azot gazı akışının altına yerleştirerek organik çözücüyü buharlaştırın, böylece tüpün alt kısmının duvarları boyunca ince bir kurutulmuş fosfolipit filmi oluşur. Amfoterisin B veya AmpB-Nanodiskleri formüle etmek için, liyofilize fosfolipid aliquot'a 450 mikrolitre PBS pipet ve lipiti dağıtmak için 30 saniye boyunca vorteks yapın. Pipet, 50 mikrolitre stok başına 20 miligramlık AmpB çözeltisini dispersiyon fosfolipid numunesine ve vortekse solüfer.
Dağılmış fosfolipid ve AmpB'yi içeren cam test tüpüne mililitre başına 500 mikrolitre dört miligram ApoE4 NT iskele proteini ekleyin. Banyo, çözelti netleşene kadar numuneyi 24 santigrat derecede sonikleştirin. AmpB-Nanodisk diyalizi için, 10 dakika boyunca damıtılmış deiyonize suya iyice batırarak diyaliz tüpünün bir bölümünü hazırlayın.
Bir diyaliz tüpü kelepçesi kullanarak, ıslatılmış diyaliz tüpünün bir ucunu kelepçeleyerek sıvının kaçamamasını sağlayın. Diyaliz tüpünün açık ucuna dar bir boyun hunisi yerleştirin ve AmpB-Nanodisk örneğini diyaliz tüpüne aktarın. Huni çıkarın ve diyaliz tüpünün ucunu başka bir diyaliz tüpü kelepçesi ile sıkıştırın.
Diyaliz tüpünün kapalı uçlarından birine bir köpük diyaliz şamandırası yerleştirin ve monte edilmiş diyaliz tüpünü taze hazırlanmış bir litrelik PBS tamponu içeren beherin içine yerleştirin. Beherin altına manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve karıştırma kontrolünü düşük seviyeye ayarlayarak bir girdap üretmemesini sağlayın. Diyalizin gece boyunca dört santigrat derecede devam etmesine izin verin.
Güç düğmesini çevirerek spektrofotometreyi açın ve PC kontrolüne basarak ilgili bir destek bilgisayarına bağlanın. Destek bilgisayarında, UVProbe 2.61 etiketli yazılımı açın ve sol alt köşedeki bağlan" düğmesine tıklayarak spektrofotometreye bağlanın. Spektruma tıklayın, ardından üst araç çubuğundaki yönteme tıklayın.
Ölçüm sekmesine tıklayın ve dalga boyu aralığı altında bulunan başlangıç metin kutusuna 500 ve son" metin kutusuna 300 girin. "Tarama hızı" etiketli sekmenin yanındaki açılır menüyü tıklayın ve orta olarak ayarlayın. Bir mililitre DMSO'yu iki kuvars küvete aktararak boş bir numune hazırlayın.
Her iki küveti de spektrofotometrenin ilgili numune portlarına yükleyin. Otomatik boşluğa tıklayın ve sol alt köşedeki başlat'a tıklayarak 300 ila 500 nanometre arasında bir spektrum kaydedin. AmpB standart spektral analizi için, küveti ön numune portundan çıkarın ve mililitre AmpB stok çözeltisi başına 20 mikrolitre bir miligram ekleyin.
Küveti numune panosuna geri yükleyin ve numune emilimini kaydetmek için başlat düğmesine tıklayın. Numune emilimini kaydettikten sonra, küveti çıkarın ve sıvı içeriğini bir atık kabına boşaltın. Küveti üç yıkama deiyonize su ile iyice durulayın, ardından% 70 etanol ile üç yıkama yapın.
Bozulmuş AmpB-Nanodisk'in spektral analizi için, mililitre başına bir miligramın 20 mikrolitresini bir mililitre DMSO'ya pipetleyerek numuneyi hazırlayın ve spektrumu kaydetmeden önce bir dakika boyunca inkübe edin. Küveti ön numune portuna yükleyin ve numune emilimini kaydetmek için "başlat" ı tıklayın. Bir PBS tampon boşluğunun spektral analizi için, bir mililitre PBS'yi iki kuvars küvete aktararak bir boşluk hazırlayın.
Küvetleri numune portuna yükleyin. Otomatik boşluğa tıklayın "ve spektrumu 300 ila 500 nanometre arasında kaydedin. Bozulmamış bir AmpB-Nanodisk numunesinin spektral analizi için, küveti ön numune portundan çıkarın ve PBS tamponuna mililitre başına bir miligramın 20 mikrolitresini ekleyin.
Küveti numune panosuna geri yükleyin. Başlat"a tıklayın ve örnek spektrumu kaydedin. AmpB-Nanodisk formülasyon reaksiyonu, numune görünümü bulanıktan berraklığa geçtiğinde tamamlanmış sayılır.
DMSO ve PBS'deki AmpB örneklerinin UV görünür absorpsiyon spektroskopisi gösterilmiştir. DMSO'da, 372, 392 ve 415 nanometrelerde üç ayırt edici absorbans maksimumu, AmpB'nin göstergesi olan zirveler gözlendi. PBS'deki AmpB-Nanodisklerin absorbans spektrumları, daha kısa bir dalga boyunda tek bir büyük absorbans zirvesi gösterdi.
Buna karşılık, DMSO'daki AmpB-Nanodisklerin absorbans spektrumları, stok AmpB'nin spektrumlarına benzer görünüyordu. AmpB-Nanodisklerin biyolojik aktivitesi, maya büyüme inhibisyon testleri değerlendirilerek gerçekleştirildi. PBS, DMSO ve yeniden yapılandırılmış yüksek yoğunluklu lipoproteinler gibi kontrol örnekleri, AmpB dışındaki nanodisk bileşenlerinin maya büyümesi üzerinde fark edilebilir bir etkisi olmadığını göstermiştir.
Pozitif kontrol, AmpB'nin maya büyümesinin etkili bir inhibitörü olduğunu doğruladı. AmpB-Nanodiskler durumunda, konsantrasyona bağlı büyüme inhibisyonu aktivitesi gözlenmiştir. Tüm nanodisk preparatları aynı değildir.
Bazıları daha fazla zaman, farklı lipitler veya farklı iskele proteinleri gerektirebilir. Onlar sadece belirsiz} nanodisk örneğinin açıklığa kavuşturulmasıdır. Bu teknik, Doksorubisin kaynaklı kardiyotoksisite, apoptoz, ligand etkileşimlerini incelemek için kullanılan yeni nanopartiküllere yol açmış ve lutein ve kurkumin dahil olmak üzere çok sayıda sulu çözünmez biyoaktif molekül sağlamıştır.
