Hasta sürücü organoid modelleri, genetik ve fonksiyonel olarak ana tümörlerini temsil eder ve bu nedenle yumurtalık kanserinde yeni terapötikleri ve karmaşık biyolojik süreçleri incelemek için güvenilir modellerdir. Klonal heterojenliği, tümör mikroçevresini ve in vitro hücreden hücreye etkileşimleri özetleyerek, bu modeller kanser hücre hatlarının ve hasta kaynaklı ksenogreftlerin sınırlamalarının üstesinden gelir. Hasta kaynaklı organoidler uzun süreli genişleme ve depolama yetenekleri sunar ve tümör fizyolojisini taklit eder.
Sonuç olarak, yeni terapötiklerin ve öngörücü biyobelirteçlerin incelenmesi için ideal modellerdir. Tümör örneklerini 10 santimetrelik bir doku kültürü kabına yerleştirerek ve tek kullanımlık bir neşter kullanarak homojen bir karışım oluşturmak için dokuyu kıyarak organoidlerin toplanmasına başlayın. Homojen doku karışımını forseps kullanarak bir ayrışma tüpüne yerleştirin.
Her bir ila iki mililitre homojenize doku için, organoid baz ortamında mililitre başına yedi ila sekiz mililitre bir miligram tip iki kollajenaz çözeltisi ve bir mililitre DNaz Bir çözeltisi ekleyin. 458 G.'deki çözeltiyi vorteksleyin Ayrışma makinesini kullanarak kollajenaz çözeltisindeyken dokuyu sıvılaştırın. Programı çalıştırın 37 C alt çizgi H alt çizgi TDK üç bir saat tek hücreli süspansiyon olana kadar.
Tamamlandığında, homojenize edilmiş karışımı yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. 20 ila 40 mililitre organoid baz ortamı ekleyin ve çözeltiyi 458 G'de vorteksleyin.Daha sonra çözeltiyi 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden yeni etiketlenmiş 50 mililitrelik konik bir tüpe filtreleyin. Daha sonra, filtrelenmiş karışımı dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1.650 G'de santrifüj edin ve bir cam mera pipeti kullanarak süpernatantı aspire edin.
Mililitre başına 100 mikrogram Dnase One hazırlayın ve damla bilge DNase One çözeltisi ekleyerek hücreleri bir mililitre Dnase One çözeltisinde yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 15 dakikalık inkübasyondan sonra hücrelere 25 mililitre organoid baz ortamı ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. Daha sonra hücreleri 1.650 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin ve bir cam mera pipeti kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin.
Yeni oluşan hücre peletini beş mililitre önceden ısıtılmış kırmızı kan hücresi veya RBC lizis tamponunda yeniden askıya alın. Her konik tüpteki çözeltileri 458 G'de vorteks edin ve beş dakika boyunca inkübe edin. Yine, RBC lizis tamponunda asılı duran peleti santrifüj edin ve bir cam mera pipeti kullanarak süpernatantı aspire edin.
Peleti 10 mililitre PBS ile yıkayın ve hücrelerin santrifüjlenmesinden önce hücreleri vorteksleyin. Büyük hücreli bir pelet için, PBS'yi aspire edin ve peletin üzerine bir mililitre organoid baz ortamı ekleyin. Çözeltiyi vorteksledikten sonra, hücre süspansiyonunun 300 ila 400 mikrolitresini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Beş dakikalık santrifüjlemeden sonra, süpernatantı aspire edin ve soğuk uçlar kullanarak bazal membran ekstraktı veya BME ve organoid baz ortamında yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınmış hücre çözeltisini 40 mikrolitrelik alikotlarda altı delikli bir plakaya yerleştirin. Kuyu başına beş aliquots'a kadar plaka.
Kuyu plakasını derhal 20 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin ve inkübasyondan sonra, her bir kuyucuğa tam organoid ortamın iki mililitresini yavaşça ekleyin. Her bir oyuğa bir mililitre organoid baz ortamı ekleyin ve ayrışma için ortamı doğrudan organoid tırnakların üzerine yukarı ve aşağı pipetleyin. Yeniden asılı peletleri içeren tüm ortamları 15 mililitrelik bir konik tüpte toplayın.
Daha sonra, süpernatanı aspire etmeden önce karışımı içeren 15 mililitrelik konik tüpü beş dakika boyunca santrifüj edin. Hücre peletine bir mililitre hayvansal kökenli serbest rekombinant enzim ekleyin. Vorteks ile karıştırın ve süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
37 santigrat derecelik bir su banyosunda 15 dakikalık inkübasyondan ve beş dakikalık santrifüjlemeden sonra, süpernatanı aspire edin. Peletin BME ve organoid baz ortamında yeniden askıya alınması ve yeniden askıya alınan hücre çözeltisinin 40 mikrolitrelik alikotlarda altı delikli bir plakaya plakalanması gerekir. Kuyu başına beş aliquots'a kadar plaka.
20 dakikalık inkübasyondan sonra, her bir kuyucuğa tam organoid ortamın iki mililitresini yavaşça ekleyin. Geçiş organoid hücre peletini 0.5 ila bir mililitre Geri Kazanım Hücre Kültürü Donma Ortamında yeniden askıya alın ve uzun süreli depolama için eksi 80 dereceye ve sıvı azot tankına aktarmadan önce her kriyo şişesine bir mililitre aktarın. Sıvı azotta depolanan kriyo şişelerini 37 santigrat derece su banyosuna aktararak organoidleri çözün.
Çözüldükten sonra, organoidleri 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın ve süpernatanı aspire etmeden önce santrifüj yapın. Daha sonra, pelet için bir mililitre PBS ekleyin ve yeniden askıya alınmış peleti 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1.650 G'de santrifüjlemeden sonra, bir cam mera pipeti kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin. Peleti BME ve organoid baz ortamında yeniden askıya alın ve yeniden askıya alınan hücreleri 40 mikrolitre alikotta altı kuyucuklu bir plakaya yerleştirin.
Kuyu başına en fazla beş aliquot yerleştirin. Kuyucuklara iki mililitre tam organoid ortam eklemeden önce plakayı hemen 20 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Organoidler 10 gün içinde kuruldu ve bundan sonra kültürde ayrı organoidler gösterdiler.
Hasta kaynaklı organoid kültürler agaroz içine gömülerek hematoksilin ve eozin boyama ile değerlendirilerek değerlendirildi. BME ile çalışmanın zorluklarını göz önünde bulundurmak önemlidir. Hücre peletinin ve BME'nin yeniden süspansiyonu, işlemde kabarcıkların oluşmamasını sağlamak için buz üzerinde yapılmalıdır.
Bu teknik, neoadjuvan kemoterapi gören hastaların karşılaştığı sorunlara bağlı olarak kemoterapinin organoid üretimi ve gelişimi üzerindeki etkisi hakkında daha fazla araştırmaya izin verir.
