Eklemeler, silmeler, çoğaltmalar ve ters çevirmeler gibi yapısal değişkenlerin geçmişte deneysel olarak takip edilmesi daha zordu ve frekansları amplikon dizilimi ile doğru bir şekilde ölçülemedi. Burada, zaman içinde yapısal varyant alel frekanslarını takip etmek için primer tasarımını ve paralel kılcal elektrofereziyi üçe katlayan basit bir uygun maliyetli teknik sunuyoruz. Bu yöntem, deneysel evrimde son nokta dizilimini tamamlamak ve ortaya çıkan de novo alellerin frekanslarını izlemek için tasarlanmıştır.
Bu yöntemin, konak içi patojen verileriyle çalışanlara da fayda sağlayacağını umuyoruz. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir araştırma görevlisi olan Jeanne Hamet olacaktır. Yöntemlerin farklı adımları, türetilmiş alelin mutS adı verilen bir bakteri genindeki IS10 yerleştirmesinden kaynaklandığı bir durumda gösterilecektir.
İlk olarak, mutant yerleştirme bölgesi etrafındaki vahşi tip alel üzerinde kısa bir amplikonu büyütmek için bir çift primer tasarlayın. Vahşi tip amplikondan hafif bir boyut değişkeni üretmek için yerleştirme sırası içinde üçüncü bir astar ileri astar iki tasarlayın. Sabit vahşi tip ve mutant alel klonlarının 24 saatlik kültürlerinden DNA çıkararak başlayın.
DNA'yı ölçtükten sonra, her DNA ekstraktını mikrolitre başına beş nanograma kadar su ile seyreltin. İki örneği 50/50 oranında sabitleyin. 10 nanogram DNA örneği, primerler ve PCR ana karışımı içeren 20 mikrolitrelik bir reaksiyon ayarlayın.
Daha sonra,% 2'lik bir agaroz jeli kullanarak PCR ürününü elektroforez ile ayırın. Yabani tipteki amplikonlar ile mutant arasındaki boyut farkı, jel üzerinde doğrulanmalıdır. Bir kalibrasyon eğrisi elde etmek için, vahşi tip DNA ve mutant DNA'yı çeşitli oranlarda karıştırarak başlayın.
PCR ürünlerini mikrolitre konsantrasyon başına 0.1 nanograma seyreltin. Ayırma jelini hazırlamak için, taze jeli ve boyayı karıştırın. Giriş arabelleğini yerine takın.
Durulama tamponunu paralel kılcal elektroforez cihazının doğru çekmece konumuna yerleştirin. 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına 22 mikrolitre seyreltici işaretleyici ekleyin. Şimdi her numuneye seyreltilmiş PCR ürünlerinin iki mikrolitresini ekleyin.
Bir kuyuya, yüksek hassasiyetli bir kitten, bir ila 6.000 baz çifti arasında değişen bir DNA boyutu merdiveni ekleyin. Mikroplakayı paralel kılcal elektroforez cihazına, cihaz yazılımındaki seçili çalıştırmada yerleştirin. Veri analiz yazılımını kullanarak sonuçları analiz edin.
İlk olarak, zirveleri bilinen boyutlarına göre tanımlayın. Bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için her amplikonu sayın. Son olarak, iki alelin göreceli miktarlarının doğru şekilde ölçüldüğünden emin olun.
Bu kalibrasyon eğrisi daha sonra PCR amplifikasyonu ve paralel kılcal elektroforez sonrası yapısal varyantların miktarını hesaplamak için kullanılır. Bu temsili sonuçlar, mutS geninde yıkıcı bir eklemeyi takip eder. Nakavtlar ve mutS, hiper mutator fenotipe yol açarak, bakterilerin baz mutasyon oranlarından daha fazla mutasyon örneklemesine izin verir.
Sunulan yöntem kullanılarak, mutS yapısal varyant frekansı 1000 nesil boyunca izlendi. Ortaya çıkan mutant alelin monotonik olmayan bir yörüngesi ortaya çıktı. Mutant alel ilk olarak 680. nesilde tespit edildi.
Alel daha sonra frekansta hızla arttı ve 713 kuşağı tarafından% 67'ye ulaştı. Bu artış daha sonra durgunlaştı, sonraki 53 nesil boyunca sadece% 10 artarak% 76'ya yükseldi Beklenmedik bir şekilde, mutant alel frekansı daha sonra 13 nesil boyunca% 76'dan% 49'a düştü ve daha sonra fiksasyona yükseldi. Bu yöntem, deneysel evrim üzerinde çalışanlara fayda sağlayacaktır.
Bu protokol, kullanıcının dondurulmuş arşivleri almasına ve uç nokta sıralama verileriyle gözlemlenemeyen evrimsel yörüngeleri keşfetmesine olanak tanır.
