يمكن تنفيذ هذا البروتوكول في معظم مختبرات البيولوجيا التنموية للمريء ، مما يسمح للباحثين الذين ليس لديهم إمكانية الوصول إلى المجاهر فائقة الدقة بإنتاج صور فائقة الدقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للباحثين بتجاوز حد الحيود للمجهر التقليدي متحد البؤر دون الحاجة إلى مجهر فائق الدقة عن طريق توسيع العينة نفسها. سيكون هذا البروتوكول مفيدا لأولئك الذين يدرسون كيفية تأثير توطين البروتين على مورفولوجيا الخلية أو وظيفتها في الأجنة السليمة ، خاصة عندما يتم تنظيم هذه البروتينات في هياكل أو شبكات تحت خلوية معقدة.
المشكلة الأكثر شيوعا التي يواجهها الناس هي فقدان الأجنة في جميع أنحاء البروتوكول. ينصح بتطبيق طبقات متعددة من Poly-L-Lysine للالتصاق بالأجنة بإحكام. بعد الأجنة ، خذ قاعدة طبق بتري بلاستيكية بطول ستة سنتيمترات مملوءة نصفها ب 3٪ أجار.
سجل مستطيلا خمسة في ثلاثة سنتيمترات في أجار بشفرة حلاقة أو مشرط. قم بإزالة لوح أجار باستخدام ملعقة مختبر صغيرة. ثم اقلب قاعدة طبق بتري ، وضعه على المقعد ، وضع لوح أجار أعلى الطبق المقلوب.
أخرج الغطاء من طبق بتري وتأكد من جفافه. باستخدام القفازات ، ضع قطعة من الشريط على الوجهين داخل الغطاء. أخرج القوارير التي تحتوي على الأجنة المطلية والثابتة من شاكر وضعها عموديا على طاولة العمل.
اسمح للمراحل العضوية والمائية بالانفصال. يجب أن تظل الأجنة الثابتة بشكل صحيح في واجهتها. قم بإزالة المرحلة المائية السفلية تماما باستخدام ماصة باستور وماصة P200.
استخدم ماصة باستور الزجاجية المزودة بمصباح لاتكس لنقل الأجنة المثبتة على لوح أجار على دفعات صغيرة متعددة حتى لا تلتصق بداخل الماصة. بمجرد أن تصبح الأجنة على لوح الآجار ، استخدم أنبوب P200 لإزالة أي هيبتان متبقي بالقرب من الأجنة. الآن ، أسقط غطاء الشريط على الوجهين على لوح الآجار من ارتفاع سنتيمترين للصق الأجنة بالشريط.
قم بإزالة الغطاء برفق من لوح أجار ، وضعه رأسا على عقب على المقعد ، وأضف ما يكفي من PBS Tween لتغطية الأجنة في الغطاء. لجمع الأجنة المطلوبة ، استخدم مجهر تشريح ستيريو بتكبير 100x مع إضاءة غير مباشرة. وخز الغشاء الزجاجي بالقرب من الطرف الأمامي أو الخلفي للجنين بإبرة زجاجية دقيقة لتفريغه وتحرير الضغط.
استخدم ملقط رفيعا أو مسبارا معدنيا لدفع الجنين برفق للخارج من خلال الفتحة مع استمرار تمسك غشاء vitelline بالشريط على الوجهين. اترك الأجنة غير المرغوب فيها على الشريط. استخدم بشكل دوري ماصة باستور الزجاجية لجمع أي جنين عائم ونقله إلى أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 ملليلتر.
قم بإعداد محلول PDMS في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر وإنشاء أنبوب متوازن عن طريق إضافة كمية مناسبة من الماء إلى أنبوب مخروطي ثان سعة 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي حل PDMS عند 500G لمدة ثلاث دقائق عند 15 درجة مئوية. ثم اسكبه في طبق بتري 10 سم على عمق ملليمتر واحد.
اسمح لمحلول PDMS بالتصلب طوال الليل عند 55 درجة مئوية. بمجرد أن يتم تثبيت لوح PDMS ، قم بتسجيل مساحات مربعة أصغر قليلا من انزلاق غطاء 22 × 22 مم باستخدام مشرط. داخل كل مربع ، سجل وأزل بئرا مربعا بعرض ثمانية ملليمترات.
انقل كل PDMS مربع جيدا على غطاء 22 × 22 ملم وألصقه بإحكام. للصق الأجنة بزلات الغطاء ، ضع ما يكفي من 0.1٪ Poly-L-Lysine لتغطية سطح انزلاق الغطاء داخل كل بئر ووضعها في حاضنة 55 درجة مئوية حتى تجف. شطف لفترة وجيزة الأجنة و PBS لإزالة منظف Tween.
ثم انقل أكثر من 10 أجنة إلى كل بئر مطلي ب Poly-L-Lysine. اسمح للأجنة بالاستقرار في قاع الآبار. قم بإزالة السائل الزائد من الأجنة الملتصقة باستخدام ماصة باستور وانتقل فورا إلى الخطوة التالية.
بينما تجلس الأجنة في محلول المونومر ، قم بإعداد محلول الهلام لتغطية آبار PDMS. تمييع المؤكسد الحفاز طازجا من مسحوق. اجمع بين 3،920 ميكرولتر من محلول المونومر مع 60 ميكرولتر من 10٪ TEMED و 20 ميكرولتر من 1٪ TEMPO.
قم بتقسيم محلول الهلام إلى حصص 125 ميكرولتر إلى أنابيب PCR متعددة. قم بإزالة محلول المونومر من آبار PDMS باستخدام فراغ أو أنبوب مع الحرص على عدم تعطيل الأجنة. أضف خمسة ميكرولترات من APS إلى أحد أنابيب PCR التي تحتوي على محلول الهلام لبدء البلمرة.
قم بتوزيع محلول البلمرة بسرعة بين الآبار الثلاثة. كرر هذا حتى يتم تغطية جميع الآبار والأجنة. دع العينات تتكاثر لمدة 1.5 إلى 2.5 ساعة عند 37 درجة مئوية.
سوف تستغرق الهلاميات المائية السميكة وقتا أطول لإكمال البلمرة والتصلب. تحريك الهلاميات المائية في كثير من الأحيان لمراقبة البلمرة. بمجرد التصلب ، لن تذبذب الهلاميات المائية.
بعد الهلام ، قشر آبار PDMS من انزلاق الغطاء دون إزعاج الهلاميات المائية. نقل الهلاميات المائية بشكل فردي إلى آبار لوحة ستة آبار. قد تتوسع الهلاميات المائية قليلا أثناء الهضم.
تغطية المواد الهلامية تماما مع العازلة الهضم. 30 ملليلتر من محلول الهضم يكفي لتغطيتها في صفيحة ستة آبار واحتضانها لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد الهضم ، انقل الهلاميات المائية إلى طبق بتري طوله ستة سنتيمترات واملأه بالماء منزوع الأيونات للتمدد.
قد تنفصل الهلاميات المائية عن انزلاقات الغطاء عند هذه النقطة وتتوسع أربع طيات في البعد الخطي. باستخدام ماصة باستور ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الماء الزائد من طبق بتري لتقليل حركة المواد الهلامية عند التعامل معها. قم بمناورة المواد الهلامية الموسعة مع الأجنة على السطح السفلي على زلة غطاء كبيرة للتصوير.
قم بتركيب كل غطاء بجل فوق هدف مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر المقلوب. بعد تحديد موقع العينات التي تم تنظيمها وتوجيهها بشكل صحيح ، تحولت إلى زيت عالي التكبير أو هدف غمر في الماء إلى صورة بدقة عالية. أظهر قياس طول الجنين على طول محور الرأس إلى الذيل تحت هدف 10x أن الأجنة غير الموسعة امتدت ما يقرب من نصف مجال الرؤية ، في حين أن الأجنة الموسعة امتدت تقريبا إلى مجالين كاملين للرؤية.
كان متوسط طول الرأس إلى الذيل للأجنة الضابطة غير الموسعة 398.8 ميكرومتر. بالنسبة للتجارب الأولى والثانية والثالثة، كان متوسط أطوال الجنين هو 4.0 أضعاف و4.7 أضعاف و4.9 أضعاف على الترتيب. في عينة التحكم ، كان متوسط عرض الخلايا في الجزء الفكي العلوي 4.76 ميكرومتر.
في العينات الموسعة ، كان متوسط عرض الخلايا في الجزء الفكي العلوي 19.10 ميكرومتر ، وهو ما يمثل توسعا بمقدار 4.0 أضعاف. تم تصوير الهيكل الخلوي actomyosin في السيطرة غير الموسعة مقابل الأجنة الموسعة ، التي تخضع لتمديد متقارب. ظهرت كخط واحد حيث التقت الخلايا المجاورة.
على النقيض من ذلك، في المرحلة السابعة الموسعة من الأجنة، يمكن ملاحظة خطوط متوازية من الميوسين اثنين عند تقاطعات الخلايا الخلوية، وهو ما يمثل تجمعات البروتين القشري في الخلايا المجاورة. في المرحلة السادسة من الأجنة غير الموسعة ، ظهرت الميتوكوندريا الموصوفة بالستربتافيدين كضباب سيتوبلازمي غير متجانس دون أي تفاصيل واضحة تحت الخلية. ومع ذلك ، في الأجنة الموسعة ، كانت العديد من النقاط قابلة للحل داخل السيتوبلازم ، ومن المحتمل أن تمثل الميتوكوندريا المجزأة أو أجزاء من شبكة الميتوكوندريا.
أحد الأشياء المهمة التي يجب تذكرها عند محاولة هذا الإجراء هو حماية الأجنة من التعرض المفرط للضوء بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية.
