Bu yöntem, primer insan hematopoetik kök ve progenitör hücrelerinde tekrarlayan lösemik fonksiyon kazancı mutasyonlarının hassas bir şekilde modellenmesini ve böylece lösemik transformasyondaki rolünün araştırılmasını sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, CRISPR-Cas9 tabanlı mutasyon mühendisliğinin bir floresan muhabirinin tanıtılmasıyla birleştirilmesidir. Bu, saf heterozig mutasyona uğramış hücre popülasyonlarının tanımlanmasına, zenginleştirilmesine ve izlenmesine benzersiz bir şekilde izin verir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırma görevlisi olan Tommaso Sconocchia olacak. Başlamak için, artı oluştur seçeneğini seçerek çevrimiçi Benchling tasarım aracını kullanarak tek kılavuzlu RNA'yı tasarlayın. Ardından, DNA dizisini tıklayın"ardından DNA dizilerini içe aktar" ve veritabanlarından içe aktar" seçeneğine tıklayın.
Sonra istediğiniz geni girin ve insan "türü" nü seçin. Ara" seçeneğine tıklayın ve doğru transkript içe aktarma işlemini seçin. Çift iplikçik kopmasının tanıtılacağı ilgi alanını seçin.
Ardından ekranın sağ tarafındaki "CRISPR" seçeneğini ve ardından tasarım ve analiz kılavuzlarını seçin. Ardından, SP-Cas9 ile düzenleme için kılavuz uzunluğunu 20 baz çiftine ve PAM dizisine tutarken "tek kılavuz" u seçin. Yüksek hedef içi puana ve yüksek hedef dışı puana sahip bir kılavuz seçin ve tek kılavuz RNA'yı ticari bir satıcıdan kimyasal olarak modifiye edilmiş sentetik tek kılavuz RNA olarak sipariş edin.
HDR şablonunu tasarlamak için, genomik diziyi ve kodlama dizisini moleküler klonlama yazılımına aktarın. Genomik dizi dosyasından, ideal olarak, çift iplikçik kırılmalarının beş ana ucundaki 400 baz çiftini seçerek sol homoloji kolunu tasarlayın ve bu diziyi yeni bir dosyaya yapıştırın. Genomik dizi dosyasından, hedeflenen intron'un son 150 baz çiftini seçerek ve sol homoloji kolundan sonra yapıştırarak ekleme alıcı dizisini tasarlayın.
Kodlama sırası dosyasından, ilgilendiğiniz cDNA'yı seçin. Codon, cDNA'yı optimize eder ve ekleme alıcı dizisinden sonra yerleştirir. İlgilenilen cDNA'dan sonra, floresan protein için bir promotör dizisini takiben üç asal poliadenilasyon sinyali ekleyin.
Ardından, floresan proteini için sırayı ve bir saniye, ancak farklı bir poliadenilasyon sinyali ekleyin. Genomik dizi dosyasından, çift iplikçik kırılmalarının üç ana ucunda ideal olarak 400 baz çifti seçerek doğru homoloji kolunu tasarlayın ve ikinci poliadenilasyondan sonra diziyi ekleyin. Ardından, tüm kalıbın bir kopyasını oluşturun ve istenen mutasyonun dizisini içerecek şekilde ilgili cDNA'yı değiştirin.
Floresan proteinini farklı bir floresan proteini ile değiştirin. HDR şablonlarını oluşturun ve AAV ifade vektörüne kopyalayın. Rekombinant AAV6 preparasyonu için, her biri% 10 FBS,% 1 penisilin streptomisin ve 25 milimolar HEPES ile desteklenmiş 20 mililitre DMEM'de 11 milyon HECK293T içeren 10 adet 150 milimetrelik tabak hazırlayın.
Ardından, bulaşıkları inkübatöre 24 saat boyunca 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit olarak yerleştirin. Eski ortamı dikkatlice attıktan sonra,% 10 FBS, 25 milimolar HEPES ve bir milimolar sodyum bütirat ile desteklenmiş 20 mililitre antibiyotiksiz DMEM ile değiştirin. Ardından, bir ve iki adet 15 mililitrelik tüp etiketli tüp hazırlayın.
Bir tüp için, beş mililitre azaltılmış serum ortamı, 60 mikrogram rekombinant AAV6 mutasyona uğramış HDR plazmid ve 220 mikrogram PDGM6 yardımcı plazmid ekleyin. İki tüp için, mililitre polietilen amin çözeltisi başına beş mililitre azaltılmış serum ortamı ve 1120 mikrolitre bir miligram ekleyin. İkinci tüpün içeriğini bir tüpe ekledikten sonra, 30 saniye boyunca vorteks yapın ve ardından oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
Her yemeğe damla damla 1.1 mililitre çözelti dikkatlice ekleyin ve yavaşça dönerek dağıtın. Bulaşıkları inkübatöre 48 saat boyunca 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit olarak yerleştirin. Daha sonra her yemeğe 250 mikrolitre 0.5 molar EDTA ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin.
Hücreleri tabakta yıkayarak toplayın ve 500 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 2000 G'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Peleti vorteks ile gevşetin ve bir AAV saflaştırma kiti kullanarak virüsü çıkarın.
Saflaştırılmış virüsü alıntıladıktan sonra, eksi 80 santigrat derecede saklayın. CD34 pozitif hematopoetik kök ve progenitör hücreleri çözdükten sonra, hücreleri% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş 10 mililitre önceden ısıtılmış RPMI'ye aktarın. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 350 G'de santrifüj.
Hematopoetik kök ve progenitör hücre tutma ortamındaki hücreleri mililitre başına 250.000 hücre konsantrasyonuna kadar askıya alın ve 72 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ardından, hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Tripan mavisi dışlaması ile hücre canlılığını sayın ve kontrol edin.
Ribokukleoprotein kompleksini hazırlamak için, 1.5 mililitrelik bir tüpe 15 mikrogram Cas9 ve sekiz mikrogram tek kılavuz RNA ekleyin ve bir ısıtma bloğunda 10 dakika boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. Ribonükleoprotein kompleksi inkübe edilirken, hücreleri beş dakika boyunca 350 G'de santrifüj edin ve süpernatanı atın. Hücreleri 100 mikrolitre nükleofeksiyon çözeltisinde askıya aldıktan sonra, hücreleri ribonükleoprotein kompleksi ile karıştırın ve küvete aktarın.
Artık hava kabarcıklarını çıkarmak için küvete hafifçe dokunduktan sonra, küveti transfeksiyon sisteminin tutucusuna yerleştirin ve hücreleri elektroporat yapın. Elektroporasyondan hemen sonra, penisilin streptomisin olmadan 400 mikrolitre önceden ısıtılmış hematopoetik kök ve progenitörler hücre tutma ortamı ekleyin ve ince bir transfer pipeti ile hücreleri, penisilin streptomisin olmadan önceden ısıtılmış hematopoetik kök ve progenitör hücre tutma ortamı içeren bir kültür plakasına aktarın. Ardından plakayı inkübatöre aktarın.
Dondurulmuş rekombinant AAV'leri içeren şişeleri buz üzerinde çözün ve her bir rekombinant AAV6'nın optimum miktarını hücre süspansiyonuna pipetleyerek hücreleri dönüştürün. Hücre süspansiyonunu pipetle hafifçe karıştırdıktan sonra, dönüştürülmüş hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte altı ila sekiz saat boyunca inkübe edin. Altı ila sekiz saat sonra, hücreleri bir tüpte toplayın ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında 350 G'de santrifüj yapın.
Süpernatantı atın ve penisilin streptomisin ile desteklenmiş taze önceden ısıtılmış hematopoetik kök ve progenitör hücre tutma ortamı ile değiştirin ve hücreleri bir hücre kültürü plakasına aktarın. Hücreleri 48 saat boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Heterozigot fonksiyon kazancı mutasyonunu taşıyan mühendislik hücrelerini akış halinde sıralamak için, hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve daha önce gösterildiği gibi beş dakika boyunca oda sıcaklığında 350 G'de santrifüj yapın.
Süpernatantı çıkarın ve% 0.1 PSA içeren bir mililitre DPBS'deki hücreleri askıya alın ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında 350 G'de tekrar santrifüj yapın. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri daha önce gösterildiği gibi hücre numarasına bağlı olarak uygun bir DPBS hacminde artı %0,1 BSA'da askıya alın. Hücreleri bir kapakla donatılmış steril bir faks tüpüne aktarın ve canlı / ölü hücre dışlaması için hücre süspansiyonuna yedi AAD veya başka bir canlılık boyası ekleyin.
Floresan raporlayıcı proteinler için çift pozitif olan canlı hücreleri, 200 mikrolitre hematopoetik kök ve progenitör hücre tutma ortamı içeren bir toplama tüpüne ayırın. Sıralanmış hücreleri daha önce gösterildiği gibi beş dakika boyunca oda sıcaklığında 350 G'de santrifüj ettikten sonra, kültürde daha fazla genişleme için mililitre başına 250.000 hücre konsantrasyonuna veya hücreleri doğrudan fonksiyonel tahliller için kullanın. Ribonükleoprotein kompleksi ile transveksiyon ve rekombinant AAV6 virüsleri ile transdüksiyondan iki gün sonra, hücreler akış sitometrisi ile analiz edildi.
Ne GFP'yi ne de BFP hücrelerini sadece GFP için pozitif olarak ifade eden ve sadece vahşi tip yapısı entegre edilmiş BFP hücreleri ifade etmeyen HDR tabanlı genom düzenlemesi olmayan hücreler, sadece mutasyona uğramış yapı entegre edilmiş BFP için pozitif hücreler ve hem vahşi tip hem de mutasyona uğramış diziler entegre edilmiş GFP ve BFP çift pozitif hücreler dahil olmak üzere dört ana popülasyon tespit edildi. PCR giriş/çıkış heterozigot hesapsal mutasyonlarının başarılı bir şekilde knock-in olduğunu doğrulamak için, sadece AAV ile inkübe edilen hücrelerden ve ribonükleoprotein ve AAV ile inkübe edilen hücrelerden, knocked-in calreticulin wild tipi ve calreticulin delesyon dizisi ile ekstrakte edilen genomik DNA üzerinde gerçekleştirildi. Hücreler, DNA ekstraksiyonundan önce her iki floresan muhabirinin eşzamanlı ekspresyonuna göre sıralandı.
Jel elektroforezinden sonra, jelden bireysel bantlar eksize edildi ve sonraki Sanger dizilimi için DNA ekstrakte edildi. Dizileme sonuçları, heterozigot hesap-mutasyona uğramış hematopoetik kök ve progenitör hücrelerde vahşi tip ve mutasyona uğramış sekansların başarılı bir şekilde kesintisiz entegrasyonunu doğruladı. Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, en iyi performans gösteren tek kılavuz RNA'yı dikkatlice seçmektir, çünkü bu, genel HDR verimliliğini ve dolayısıyla heterozigot mutasyonların başarılı bir şekilde vurulma sıklığını belirleyecektir.
Bu prosedürü takiben, genetiği değiştirilmiş hücreler, koloni oluşturan birim testleri, farklılaşma testleri ve bağışıklık eksikliği olan farelere transplantasyon gibi fonksiyonel in-vitro ve in-vivo deneyler için kullanılabilir.
