Bu protokol, BFU-E ve CFU-E eritroid progenitörlerinin doğrudan kemik iliği ve dalak gibi yeni hasat edilmiş fare dokusundan tanımlanmasına ve izole edilmesine izin verir. Bu tekniği kullanarak, önceki akış protokolleriyle mümkün olmayan saf eritroid progenitörleri popülasyonlarını izole edebiliriz. Bu yöntem, birçok aşağı akış deneyi için progenitör izolasyonuna izin vererek eritroid hastalığı fare modellerini inceleme yeteneğimizi büyük ölçüde geliştirir.
Başlamak için, yeni disseke edilmiş femurları ve tibiayı doğrudan soğuk boyama tamponuna veya SB-5'e yerleştirin ve tüpleri kemik iliğini çıkarmaya hazır olana kadar buz üzerinde tutun. Bir kovada buz üzerine temiz sterilize edilmiş bir harç yerleştirin ve kemikleri harçlara aktarın. Diseksiyon makasını kullanarak, her kemiğin yaklaşık 1 milimetrelik uçlarını kesin.
İliği kemiklerden temizlemek ve harç içine toplamak için SB-5 içeren 26 gauge iğne ile donatılmış 3 mililitrelik bir şırınga kullanın ve kemikler renksiz görünene kadar her seferinde taze tampon kullanarak işlemi 3 ila 5 kez tekrarlayın. Yıkanmış iliği 100 mikrometrelik bir ağdan filtreleyin ve hücreleri buz üzerine yerleştirilmiş 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. Daha sonra, yıkanmış kemikleri 5 ila 10 mililitre SB-5'te ezmek için harcı ve havaneyi kullanın.
Ezilmiş kemiklerin ve tampon karışımını, daha önce toplanan hücrelerle havuzlamak için 100 mikrometrelik hücre süzgecinden süzün. Buz üzerine yerleştirilmiş 50 mililitrelik boş bir santrifüj tüpü üzerine 100 mikrometrelik bir ağ filtresi yerleştirin. Ağ filtresine tek bir dalak yerleştirin ve kurumadığından emin olmak için dalağa 0,5 ila 1 mililitre SB-5 ekleyin.
3 veya 5 mililitrelik bir şırınga pistonunun kauçuk tarafını kullanarak, dalağı ağdan ezin. Bir seferde daha fazla SB-5, 5 mililitre ekleyin ve tüm hücreler tüpte toplanana kadar püre haline getirmeye devam edin. Büyük bir delik ucu kullanarak toplanan hücreleri 2 mililitre SB-5 ile yukarı ve aşağı pipetleyerek tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın.
Floresan eksi bir veya FMO kontrollerini, FMO'nun adaşı antikoru dışındaki tüm antikorları FACS tüpündeki hücre süspansiyonuna ekleyerek sabitleyin. Tek renkli kontrolleri boyamak için, FACS tüpündeki hücre süspansiyonuna tek bir antikor ekleyin. Her kontrol tüpünü 3000 RPM'de 2 ila 3 saniye boyunca vorteks yapın ve daha sonra karanlıkta 2,5 saat sallanarak 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, hücreleri SB-5 ile yıkayın ve hücre süspansiyonunun hacmini SB-5 ile 4 mililitreye kadar yapın. Hücreleri 900 g'da 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede döndürün ve süpernatanı aspire edin. 300 mikrolitre SB-5'teki lekesiz ve tüm tek renkli kontrolleri yeniden askıya alın ve 40 mikrometrelik bir filtre ağından yeni FACS tüplerine filtreleyin.
SB-5'te DAPI stokunu 1 ila 10.000 oranında seyrelterek bir DAPI SB-5 çözümü oluşturun. FMOS'u 1,8 mililitre DAPI SB-5 ve DAPI tek renkli kontrolde 300 mikrolitre DAPI SB-5'te yeniden askıya alın, ardından 40 mikrometrelik bir filtre ağından yeni FACS tüplerine filtreleyin. Antikor ana karışımını her numuneye ekledikten sonra, tüpleri 3000 rpm'de 2 ila 3 saniye boyunca vorteksin ve ardından sallanma durumunda 2,5 saat boyunca karanlıkta 4 santigrat derecede inkübasyon yapın.
Hücreleri daha önce gösterildiği gibi yıkadıktan sonra, numuneleri 1.8 mililitre DAPI SB-5'te tekrar askıya alın ve 40 mikrometrelik bir filtre ağından yeni bir FACS tüpüne süzün ve numuneleri bir sistometre kullanarak analiz edin. Kalıntıları boyuta göre kaldırmak için ileri saçılımı kullanın, ardından hücre toplamlarını hariç tutmak ve tek hücreleri seçmek için ileri dağılım yüksekliği ile ileri dağılım alanı histogramını kullanın. Dışlamayı yan dağılım yüksekliği ve yan dağılım alanı histogramı ile tekrarlayın.
DAPI için pozitif hücreleri kapatarak ölü hücreleri hariç tutun. Soy negatif TUR bir 19 negatif kit pozitif hücrelerini seçin. Ve bunlardan CD 55'i ifade eden bir alt popülasyon seçin.
Soy negatif TUR bir 19, negatif kit, pozitif, CD 55 pozitif hücreleri CD 49 F ve CD 1 0 5 ekspresyonuna dayanarak P altı ve P yedi olmak üzere 2 ana popülasyona bölün. Şimdi CD 150 ve CD 41'in ifadesine dayanarak, P 6'yı daha da P 3, P 4 ve P 5'e bölün. Benzer şekilde, CD 150 ve CD 71'in ifadesine dayanarak, P 7'yi BFUE, erken CFUE ve geç CFUE'ye daha da alt bölümlere ayırın.
Bu çalışmada, yeni hasat edilen kemik iliği ve dalak hücrelerinden patlama ve koloni oluşturan birimler tespit edilmiştir. 72 saatlik eritropoietin veya farelerde araç enjeksiyonundan sonra, eritropoietin stimülasyonu, hasat edilen kemik iliği ve dalak hücrelerinde erken ve geç koloni oluşturan birim popülasyonların P 1 düşük ve P 1 yüksek genişlemesini gösterdi. Kemik iliği ve dalak progenitörlerinin in vivo eritropoietine yanıtı, erken ve geç koloni oluşturan birim popülasyonlarda P 1 düşük ve P 1 yüksek araç kontrolüne kıyasla daha fazla sayıda hücre gösterdi.
Hücreleri antikorlarla etiketlemeden önce tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak en önemlisidir. Bu, tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleme yaparak ve EDTA'yı tampona dahil ederek elde edilebilir. Saflaştırılmış progenitörler, herhangi bir aşağı akış hücresel ve moleküler analiz için kullanılabilir.
Örneğin, tek hücreli transkriptomik, atesque, koloni tahlilleri ve biyokimya. Bu teknik, tek hücreli RNA-seq deneylerinden elde edilen tahminleri test etmemize yardımcı oldu.
