Vezikülün sitoplaziye endositozu hücre içi veziküllerin oluşumu ile sonuçlanır. Vezikülün geçirgenliği çeşitli sinyal yollarını aktive eder. Kromofor yardımlı lazer inaktivasyonu, hücre içi vezikül rüptürünün sonucunu incelemek için kullanılır.
Hücre içi veziküllere hücre altı hasarın mekansal ve zamansal kontrolü, ayakta durma durumunu ve ışık aydınlatmasını ayarlayarak sağlanabilir. Başlamak için, DMEM'de% 10 FBS ile desteklenen HeLa hücre kültürünü koruyun. Hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, hücreleri tripsizleştirin.
Daha sonra,% 10 FBS ile desteklenen DMEM'deki hücreleri yeniden askıya alın. 300 nanogram Gal3-GFP plazmidini 25 mikrolitre indirgenmiş serum ortamında seyreltin. Ardından 0.6 mikrolitre P3000 reaktifi ekleyin.
Ve yavaşça karıştırın, ardından çözeltiyi vorteksleyin. 0.45 mikrolitre Lipofectamine 3000 reaktifini 25 mikrolitre azaltılmış serum ortamında seyreltin ve yavaşça karıştırın. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.
Daha sonra seyreltilmiş DNA ve seyreltilmiş Lipofectamine 3000'i karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. DNA lipofektamin karışımını, 300.000 askıya alınmış HeLa hücresini ve% 10 FBS ile 200 mikrolitre DMEM'yi karıştırdıktan sonra, hücreleri 35 milimetrelik bir cam düğme kabının merkezi cam bölgesine tohumlayın. Hücre bağlanmasına izin vermek için, hücreleri en az dört saat boyunca% 5 karbondioksit ile sağlanan inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin.
Bir mikromolar AlPcS2a çözeltisi yapmak için% 10 FBS ile desteklenmiş DREM'de AlPcS2a'yı seyreltin. AlPcS2a içeren ortamı 37 santigrat derecelik bir su banyosunda önceden ısıtın ve kültür ortamını AlPcS2a içeren ortamla değiştirin. Hücreleri, gece boyunca% 5 karbondioksit ile beslenen inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, ortamı taze ortamla değiştirdikten sonra hücre dışı AlPcS2a'yı çıkarmak için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Endositik yol boyunca kalan boyanın lizozomlara birikmesine izin vermek için dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Lizozomlara zarar vererek tek hücreleri manipüle etmek için, kültür kabını konfokal mikroskop sahnesine yerleştirin.
Heyecan verici GFP ve AlPcS2a için sırasıyla 488 nanometre ve 561 nanometre lazerleri kullanın. Hasar görmek üzere seçilen AlPcS2a etiketli veziküller üzerinde beşe beş mikrometre karelik bir ilgi alanı çizin. Daha sonra darbe, ilgilenilen bölgeyi 0.21 miliwatt'lık 633 nanometre lazerle veya 70 tekrarla aydınlatır.
Lizozomal membran geçirgenliğinin bir göstergesi olarak Gal3 puncta oluşumunu izleyin. HeLa hücrelerinde AlPcS2a ile lizozomal boyama, ticari olarak temin edilebilen belirteçler kullanılarak gerçekleştirildi ve yeşil floresan boya ile pozitif boyandı. TagRFP-Galectin3 eksprese edilen HeLa hücrelerindeki lizozomlar AlPcS2a ile boyandı.
Yakın kızılötesi ışıkla aydınlatmaya odaklanmanın ardından, sonuçlar AlPcS2a bazlı kromofor yardımlı lazer inaktivasyonunun, ilgili bölgedeki lokal lizozomal rüptürü kontrol edebildiğini ve lizozomların geri kalanını bozulmadan bıraktığını göstermektedir. Bu adım önemlidir, çünkü inkübasyon süresi ayakta duran endozomları veya lizozomları belirleyecektir. Örneğin, insanlar membran geçirimsiz boyanın salınımı ile boyutunu belirleyebilirler.
Ayrıca endozomları ve lizozomları ayırt etmek için FITC dekstran gibi pH'a duyarlı boyalar da kullanılabilir. Bu teknik, hücre içi vezikül membran rüptürünün aşağı yönlü etkilerini başlatmak için yararlıdır. Ve çeşitli durumlarda aşağı akış etkileri vardır.
