Protokolümüz, sinir liflerinin gözlemlenmesinde hassasiyet sağlayabilecek konfokal mikroskop kullanarak senkronizasyon bölümünü gözlemlemek için uygulanabilir bir yöntem sağladı. Basit ve kolay doku temizleme protokolü bu tekniğin temel avantajıdır. Doku temizleme işlemi verimlidir ve yaklaşık 30 dakika ila bir saat sürer.
Metin el yazmasında belirtildiği gibi ötenazi sıçanı üzerinde perfüzyon yapın. Dorsum derisini ve tabanını arka pençeden çıkarmak için bir neşter kullanın. Dondurulmuş bir bölüm gerektiren örnekler için, dokuları iki saat boyunca 0.1 molar PB'de aldehitten% 4 oranında sabitleyin.
Yıkadıktan sonra, cilt dokularını 37 santigrat derecede %2 agaroza gömün ve soğutmak için buz kutusunun içine yerleştirin. Titreşimli mikroton üzerine monte edilen dokuyu buzlu suyla sabitleyin ve enine yönde 500 mikrometre kalınlığında dilimleyin. Dilimledikten sonra, agarozu bölümlerden çıkarın ve 1x PBS ile altı kuyucuklu bir plakada saklayın.
Doku kesitlerini, dört santigrat derecede gece boyunca 1x PBS'de% 2 triton X-100'lük bir çözelti içinde inkübe edin. Doku bölümlerini bloke edici tampona yerleştirin ve çalkalayıcıda gece boyunca dört santigrat derecede dakikada 72 rotasyonda döndürün. Doku kesitlerini, mikro santrifüj tüpündeki seyreltme tamponunda fare monoklonal anti-CGRP ve koyun poliklonal anti-LYVE-1 antikorunun birincil antikorlarını içeren çözeltiye aktarın.
Daha sonra çalkalayıcı üzerinde iki gün boyunca dört santigrat derecede döndürün. Doku bölümlerini oda sıcaklığında yıkama tamponu ile iki kez yıkayın, ardından yıkama tamponunda dört santigrat derecede gece boyunca çalkalayıcıda tutun. Ertesi gün, doku bölümlerini bir mikro santrifüj tüpünde ikincil antikorları içeren karışık çözeltiye aktarın ve çalkalayıcı üzerinde dakikada 72 rotasyonda dört santigrat derecede beş saat boyunca döndürün.
Doku kesitlerini, oda sıcaklığında bir saat boyunca iki kez yıkama tamponu ile altı kuyucuklu bir plakada yıkayın. Doku bölümlerini çalkalayıcı üzerindeki yıkama tamponunda gece boyunca dört santigrat derecede tutun. Doku kesitlerini doku temizleme reaktifine aktarın ve çalkalayıcı üzerinde dakikada 60 rotasyonda oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe döndürün.
Şeffaf dokuları slayta monte edin, ardından dokuları bir ara parça ile daire içine alın ve boşluğu taze doku temizleme reaktifi ve kapak kayması ile yapıştırın. 3D patern, CGRP pozitif sinir liflerinin deri altı dokusundan ve dermisten epidermise geçtiğini gösterdi. Bu sinir lifleri, dermis içinde dallanmış deri altı dokusunda demetler halinde koştu ve epidermiste sonlandı.
Buna karşılık, pozitif kan damarlarındaki faloidin ve LYVE-1 pozitif lenfatik damarlar deri altı dokusunda ve dermiste dağılır. Genellikle CGRP pozitif sinir lifleri, kıllı ve göz kamaştırıcı ciltte 3D bir ağ oluşturan kan damarlarına ve lenfatik damarlara paralel olarak koştu veya onları çevreledi. Konvansiyonel yaklaşımla, sinir lifleri kan damarları ve lenfatik damarlar ince kesitlerde CGRP faloidin ve LYVE-1 ile açıkça etiketlenmiş olmasına rağmen, bu yapıların gözlenmesi dilim kalınlığı ile sınırlıydı ve tam olarak gözlenemiyordu.
30 mikrometre kalınlığa sahip kesitte CGRP pozitif sinir liflerinin yüzey alanında tüylü deri ile göz kamaştırıcı deri arasında fark yoktu. 300 mikrometre kalınlığındaki doku kesitlerinde, saçlı deri ile karşılaştırıldığında, göz kamaştırıcı cildin CGRP pozitif sinir liflerinin yüzey alanı önemli ölçüde artmıştır. Antikor inkübasyonundan sonra temizleme tamponunun yüksek ozmotik basınçla kullanılması önemlidir.
Birkaç kez, immüno-floresan boyama için gereken temizleme süresi gereklidir. Bu prosedürü takiben, altı bölümde diğer doku ve organların boyanması ve gözlemlenmesi olasılığının da mevcut olduğuna inanıyoruz. Bu teknik, nörobilim araştırmacılarının yüzey alanı ve nöro liflerin durumuyla karşılaşmalarına yardımcı olabilir.
Ayrıca doku ve organların inovasyonunu gözlemlememize yardımcı olur.
