Наш протокол обеспечил осуществимый метод наблюдения синхронного участка с помощью конфокального микроскопа, который мог обеспечить точность в наблюдении нервных волокон. Простой и легкий протокол очистки тканей является основным преимуществом этой техники. Процесс очистки тканей эффективен и занимает от 30 минут до одного часа.
Проведите перфузию на усыпленной крысе, как указано в тексте рукописи. Используйте скальпель, чтобы удалить кожу спинки и подошвы с задней лапы. Для образцов, требующих замороженного среза, постфиксируют ткани в 4% от альдегида в 0,1 молярного ПБ в течение двух часов.
После умывания встраивают ткани кожи в 2%-агарозу при 37 градусах Цельсия и помещают их внутрь ледяного ящика для охлаждения. Зафиксируйте навесные ткани на вибрационном микротоне ледяной водой и нарежьте их толщиной 500 мкм в поперечном направлении. После нарезки удалите агарозу из секций и храните их в шестилуночной пластине с 1x PBS.
Инкубируют участки ткани в растворе 2%-тритона X-100 в 1x PBS на ночь при четырех градусах Цельсия. Поместите участки ткани в блокирующий буфер и вращайтесь со скоростью 72 оборота в минуту на шейкере в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Переведите участки ткани в раствор, содержащий первичные антитела мышиного моноклонального анти-CGRP и овечьего поликлонального анти-LYVE-1 антитела в буфере разведения в микроцентрифужной трубке.
Затем вращайте шейкер в течение двух дней при четырех градусах Цельсия. Дважды вымойте участки тканей с помощью промывочного буфера при комнатной температуре, затем держите их на шейкере на ночь при четырех градусах Цельсия в буфере для стирки. На следующий день переложите участки ткани в смешанный раствор, содержащий вторичные антитела, в микроцентрифужную трубку и вращайте на шейкере со скоростью 72 оборота в минуту в течение пяти часов при четырех градусах Цельсия.
Промывайте участки ткани в шестилуночной пластине с промывочным буфером дважды в течение одного часа при комнатной температуре. Держите участки ткани в моющем буфере на шейкере в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Перенесите участки ткани в реагент для очистки тканей и вращайте со скоростью 60 оборотов в минуту на шейкере осторожно в течение одного часа при комнатной температуре.
Установите прозрачные ткани на слайд, затем обведите ткани распоркой и приклейте щель свежим реагентом для очистки тканей и крышкой. 3D-паттерн продемонстрировал, что положительные нервные волокна CGRP проходили через подкожную клетчатку и дерму в эпидермис. Эти нервные волокна проходили пучками в подкожной клетчатке, разветвленной в дерме и заканчивающейся в эпидермисе.
Напротив, фаллоидин в положительных кровеносных сосудах и положительные лимфатические сосуды LYVE-1 распределяются в подкожной клетчатке и дерме. Как правило, положительные нервные волокна CGRP проходили параллельно или окружали кровеносные сосуды и лимфатические сосуды, образуя 3D-сеть в волосатой и блестящей коже. При традиционном подходе, хотя нервные волокна кровеносных сосудов и лимфатических сосудов были четко обозначены фаллоидином CGRP и LYVE-1 в тонких срезах, наблюдение этих структур было ограничено толщиной среза и не могло наблюдаться полностью.
В разрезе толщиной 30 микрометров не было выявлено разницы между волосатой кожей и глянцевой кожей в площади поверхности CGRP-положительных нервных волокон. В 300-микрометровых толстых тканевых срезах, по сравнению с волосатой кожей, площадь поверхности CGRP-положительных нервных волокон глянцевой кожи была значительно увеличена. Важно использовать очищающий буфер с высоким осмотическим давлением после инкубации антител.
В несколько раз необходимо время очистки, необходимое для иммунофлуоресцентного окрашивания. После этой процедуры мы считаем, что существует возможность окрашивания и наблюдения за другими тканями и органами в шести секциях. Этот метод может помочь исследователям нейробиологии, сталкивающимся с площадью поверхности и состоянием нервных волокон.
Это также помогает нам наблюдать инновации тканей и органов.
