Bu protokol, koloni bakım maliyetini düşüren ve kene beslenmesi için gereken omur hayvanlarının sayısını azaltan daha az sayıda kene kullanmamıza izin verir. Bu protokol yaklaşık 20 kene gerektirir. Bununla birlikte, küçük bir örneklem büyüklüğü kullanmanın yanı sıra ana avantaj, bu protokolün birden fazla kene türüne ve farklı yaşam aşamalarına uygulanabilmesidir.
Kene diseksiyonları veya konakçı-parazit etkileşimlerine yönelik uygulamanın yanı sıra, patojen enfeksiyonun mikroRNA sekresyonuna etkisi ve fizyolojik değişikliklerin keneler tarafından salgılanan mikroRNA üzerindeki etkisi. Başlamak için, 26.3 mililitrelik bir polikarbonat santrifüj şişesine fetal sığır serumu, triptoz fosfat suyu,% 10 lipoprotein kolesterol konsantresi,% 5 sodyum bikarbonat, HEPES ve L15C300 ortamı ekleyerek vezikülsüz ortam hazırlayın ve hacmi gerektiği gibi ayarlayın. Şimdi ortamı 18 saat boyunca dört santigrat derecede 100.000 kez G'de ultrasantrifüj yapın.
Peleti rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın ve süpernatantı taze bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü bir kez daha ultrasantrifüj yapın. Süpernatantı alın ve kirleticileri gidermek için 0,22 mikrometrelik bir filtreden geçirin.
Süpernatantı 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne pipetleyin ve gerekene kadar veya üç yıla kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. 24 delikli bir kültür plakasının her bir kuyucuğundaki 500 mikrolitre vezikülsüz ortama uygun miktarda antibiyotik ekleyin. Şimdi, bakteriyel büyümeyi önlemek için vezikülsüz ortam içermeyen kuyucuklara rifampisin içeren PBS ekleyin.
Keneler, diseksiyon mikroskobu altında çift taraflı halı bandı ile bir cam slayt üzerine yerleştirin. Diseksiyondan önce, kene rifampisin içeren PBS ekleyin ve dört milimetre Vannas makası kullanarak, her dişinin yanında yaklaşık bir milimetrelik bir kesi yapın. Şimdi, kenenin sırt tarafını ve tükürük bezlerini çıkarın, ardından 24 kuyucuklu doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakada tek bir kuyucuğa eklenen 500 mikrolitre vezikülsüz ortama 20 ila 40 kene tükürük bezi koyun.
Hücre dışı veziküllerin salgılanmasına izin vermek için tükürük bezi örneklerini 24 saat boyunca 32 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, tükürük bezlerini içeren tüm ortamları 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 300 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe aktarın.
Tükürük bezlerini içeren peleti RNA'da daha sonra yeniden askıya alın ve kullanılıncaya kadar veya süresiz olarak eksi 80 santigrat derecede saklayın. Şimdi, süpernatantı 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 2.000 kez G'de santrifüj yaparak hücresel kalıntıları çıkarın ve süpernatantı yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Daha sonra, apoptotik cisimleri ve daha büyük hücre dışı vezikülleri çıkarmak ve süpernatantı taze bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüj yapın.
Daha sonra 10 mililitrelik bir şırınga üzerine bir mikrometre naylon şırınga filtresi monte edin ve ultrasantrifüj tüpünde tutun. Ardından numuneyi ekleyin ve şırıngayı 10 mililitre PBS ile doldurun. Süpernatantı filtreden tüpe geçirin.
Tüpleri filtreledikten ve dengeledikten sonra, bunları 70 Ti'lik bir rotora yerleştirin ve tüpleri dört santigrat derecede 18 saat boyunca 100.000 kez G'de ultrasantrifüj yapın. Konsantre hücre dışı veziküller, ultrasantrifüjlemeden sonra bir pelet oluşturur. Peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve peleti PBS'de yeniden askıya alın.
Hücre dışı vezikülün 500 mikrolitresini 300 K santrifüj filtreye pipetleyin ve ortam sıcaklığında 10 dakika boyunca 8.000 kez G'de santrifüj yapın ve tüm hücre dışı veziküller filtrelenene kadar bu prosedürü tekrarlayın. Son olarak, kolona 400 mikrolitre sterilize PBS ekleyin ve membrana bağlı hücre dışı vezikülleri çıkarmak için iyice karıştırın. Daha sonra numuneyi 1.5 mililitrelik DNAaz RNAse serbest tüpüne koyun.
Hücre dışı veziküllerin konsantrasyonu ve büyüklüğü, cinsiyete ve kadınlar, erkekler ve nimfler için biyolojik kopyalar arasındaki kenelerin yaşam aşamasına bağlı olarak değişmiştir. Tüm kombine biyolojik replikalar için benzer sonuçlar gözlenmiştir. Tükürük bezinden izole edilen küçük RNA'ların analizi, ribozomal RNA ve mikroRNA'lara karşılık gelen bantları gösterdi.
Bununla birlikte, tükürük bezlerinden izole edilen veziküllerde ribozomal RNA'lar yoktu ve hücre dışı veziküllerden saflaştırılmış mikroRNA örnekleri daha fazla bozulma gösterdi. Zenginleştirmeden sonra, EV'lerden saflaştırılan mikroRNA örnekleri, cDNA kütüphanesi sentezi için minimum bozulma ve yeterli mikroRNA konsantrasyonu gösterdi. cDNA kütüphanesi hazırlığı elde edildikten sonra yaklaşık 150 baz çiftinin beklenen bant boyutu, küçük RNA cDNA kütüphanelerini gösterir.
Vezikülsüz hazırlık sırasında, dış vezikül kontaminasyonunu önlemek için adımları izlediğinizden emin olun. İyi plaka hazırlığı sırasında, kene mikrobiyomundan bakteriyel kontaminasyonu önlemek için antibiyotik eklediğinizden emin olun. Bu protokol kullanılarak ekstrakte edilen mikroRNA'lar, mikroRNA yol hedeflerini tahmin etme, inhibisyon ve taklit deneyleri gibi mikroRNA rollerini doğrulamak için profilleme ve fonksiyonel deneyler için kullanılabilir.
