Bu protokol, açık alev ihtiyacını ortadan kaldıran C.Elegans ile kullanım için aseptik bir teknik sunar. Bu tekniğin başlıca avantajları, açık alevi ortadan kaldırarak güvenlik tehlikelerini azaltması ve gaz hatları olmayan laboratuvar alanlarında ve laminer akış davlumbazlarında kullanılabilmesidir. Aletleri yanlara dokunmadan sterilizasyon alanının içine ve dışına taşımak zor olabilir, ancak bir kılavuz eklemek ve elinizi stabilize etmek hareketi kolaylaştırır.
Mikro yakma fırınına bir döngü tutucu aksesuar kılavuzu takarak başlayın ve dış namluya kırpın. Mikro yakma fırınını uygun şekilde standart bir 120 veya 230 voltluk elektrik prizine takın. Mikro yakma fırınını Yüksek ayara getirin ve 800 ila 825 santigrat derece arasında optimum bir sıcaklığa ulaşmak için 10 ila 20 dakika ısınmasına izin verin.
Aleti kılavuz boyunca kaydırarak yanlara dokunmadan silindirik sterilizasyon alanına yerleştirin. Aleti sterilizasyon alanında beş ila yedi saniye tutun. Kılavuz boyunca geriye doğru kaydırarak yanlara dokunmadan aleti çıkarın.
Toplamalar için, yanmasını önlemek için bir solucana dokunmadan önce cihazın üç ila beş saniye soğumasını bekleyin. Solucanları topladıktan sonra, toplama üzerindeki solucanları yakmak için toplama kabına beş ila yedi saniye boyunca tekrar yerleştirin. Kauçuk boru kullanarak gaz hattına bir Bunsen brülörü bağlayın.
Boruyu sıkıca sabitlediğinizden ve brülörü baş üstü nesnelerden uzağa yerleştirdiğinizden emin olun. Gaz hattındaki düğmeyi çevirerek gazı açın. Brülörü bir forvet veya çakmak kullanarak ateşleyin.
Mavi bir koni görünene kadar gaz düğmesini ve hava girişini kullanarak alevi ayarlayın. Toplamayı, spatulayı veya neşteri kırmızı parlayana kadar alevin içinde tutun. Toplamalar için, yanmasını önlemek için bir solucana dokunmadan önce cihazın üç ila beş saniye soğumasını bekleyin.
Solucanları topladıktan sonra, toplama üzerindeki solucanları yakmak için toplama işlemini aleve yeniden yerleştirin. Kültür OP50 Luria suyundaki E.coli bakterileri, 37 santigrat derece çalkalayıcıda gece boyunca bulunur. Gece kültüründen sonra, kültürü steril suda 1:100 oranında seyreltin.
Bir Bunsen brülörü veya bir mikro yakma fırını kullanılarak sterilize edilmiş bir solucan kepçesini bakteriyel çözeltiye batırın, yeniden sterilize edin ve 100 mikrolitre steril suda döndürün. Pozitif kontrol için, toplayıcıyı bakteriyel çözeltiye batırın, steril suya batırın ve negatif kontrol için, toplayıcıyı bakteriyel çözeltiye batırmadan sterilize edin ve ardından steril suya çevirin. 10 mikrolitre suyu 10 santimetrelik bir Luria suyu agar Petri kabına yerleştirin, steril bir hücre dağıtıcı kullanarak suyu yayın ve kapak açıkken 24 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
Kuluçka döneminden sonra kolonileri manuel olarak sayın. Bağıl kontaminasyon oranı, numune başına koloni sayısı sayılarak ölçülmüştür. Negatif kontrol plakalarında sıfır koloni bulundu.
Standart hatası 0.3 koloni olan ortalama 4.7 koloni sayısı, Bunsen brülörü toplamaları sterilize etmek için kullanıldığında elde edildi. Mikro yakma fırını durumunda standart hata 1.2 koloni olan ortalama 3.3 koloni sayısı gözlenmiştir. Bununla birlikte, pozitif kontrol koşulunda ortalama 298.3 koloni sayısı elde edildi.
Böylece, mikro yakma fırını, Bunsen brülörü için eşit derecede etkili sterilite sonuçları elde etti. Bu prosedürü takiben, C.Elegans'ın toplanmasını veya parçalanmasını içeren herhangi bir yöntem gerçekleştirilebilir. Bu nedenle, çok çeşitli araştırma sorularına uygulanabilir.
