Bu protokol, bu proteinlerin bitki konakçılarındaki işlevini daha fazla araştırmak için yaprakçıkların ve bitki konakçılarının tükürük proteinlerini tespit etmek için bir teknik sağlar. Bu tekniğin uygulanması kolaydır ve sistem kararlı ve tekrarlanabilirdir. Bu yöntem aynı zamanda diğer hemiptera ve bitki konakçılarının tükürük proteinlerinin tespitinde de yardımcı olabilir.
Başlamak için, yetişkin yaprakçıkları pirinç fideleri üzerinde 40 x 35 x 20 santimetrelik bir küp kafesinde arkanıza koyun. Havalandırma için kafesin bir tarafını böcek geçirmez bir ağ ile örtün. Kafesleri, yaprakçıklarla birlikte, 16 saat aydınlık ve sekiz saatlik karanlık bir fotoğraf periyodu altında% 60 ila% 75 bağıl nem ile 26 santigrat derecede dahili bir nem kontrolörü içeren bir inkübatöre yerleştirin.
Haftada bir kez, tüm yetişkinleri kafeslerinden taze pirinç fideleri içeren yeni bir kafese nazikçe aktarmak için bir aspiratör kullanın. 200'den fazla yetişkinin çiftleşmesine ve pirinçte yumurta bırakmasına izin verin. Perileri ortaya çıkarması için eski pirinç fidelerini saklayın ve bu yeni virülifer olmayan nimfleri ikinci instar aşamasına getirin.
Aspiratörü kullanarak, ikinci instar virülifer olmayan nimfleri açlık için bir ila iki saat boyunca bir cam kültür tüpüne dikkatlice aktarın. Daha sonra nimfleri bir tencerede yetişen pirinç cücesi virüsü enfekte pirinç bitkisi içeren bir kafese bırakın ve nimflerin enfekte olmuş pirinç bitkisi üzerinde iki gün boyunca beslenmelerine izin verin. İki gün sonra, bu nimfleri taze virüssüz pirinç fideleri içeren yeni bir kafese dikkatlice aktarın ve pirinç cüce virüsünün dolaşım bulaşma süresini tamamlamak için nimflerin 12 gün boyunca virüssüz pirinç fideleri üzerinde beslenmelerine izin verin.
Tükürük proteinlerini toplamak için, bir ucunda böcek geçirmez ağ ile kaplı beş küçük boru benzeri besleme kafesi hazırlayın. Her besleme kafesine 15 ila 20 yaprak tutucu koyduktan sonra, kafesin diğer ucunu ince bir köpük paspas ile örtün. Bir pirinç fidesini kafesin ucu ile bantlı bir köpük paspas arasına sabitleyin ve besleme kafesindeki yaprakçıkların kafesin içine maruz kalan pirinç fideleriyle beslenebilmesini sağlayın.
Fide köklerini suya batırın, böylece pirinç bitkisi canlı kalır ve yaprakçıkların iki gün boyunca beslenmelerine izin verin. İki gün sonra, yaprakçıkları besleme kafeslerinden çıkarın ve yaprakçıkların beslendiği pirinç fidelerini toplayın. Fideleri kafesin dışında kesin ve fidelerin beslenme bölgelerini geri kazanın.
Hazırlanan 5x tamponun 200 mililitresini 800 mililitre steril su ile seyrelterek 1x Tris-Glisin tamponu hazırlayın. Daha sonra 10x TBS tamponu hazırlayın ve çözeltiyi 15 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklavlayın. Ardından, 4x protein numune arabelleğini hazırlayın.
Daha sonra 800 mililitre Tris-Glisin tamponunu 200 mililitre metanol ile karıştırarak transfer tamponunu hazırlayın. Son olarak, 100 mililitre 10x TBS ve üç mililitre Tween 20 ila 900 mililitre steril su ekleyerek TBST çözeltisini hazırlayın. Tükürük ve viral proteinleri tespit etmek için, doku toz haline gelene kadar pirinç örneklerinin 0.1 gramını sıvı azotla öğütün.
Daha sonra numuneye 4x protein numune tamponunun 200 mikrolitresini ekleyin ve 10 dakika kaynatın. Numuneleri santrifüj edin ve süpernatantı yeni bir şişeye aktarın. Numunenin 10 mikrolitresini bir SDS-PAGE jeline yükleyin ve 45 ila 60 dakika boyunca 150 voltta Tris-Glisin tamponunda çalıştırın.
Jel çalışırken, 0.45 mikron nitroselüloz membranı ve diğer sandviç malzemelerini 30 dakika boyunca transfer tamponuna yerleştirin. Çalıştırmadan sonra, jeli sandviçleyin ve transfer tamponunda 100 voltta 90 ila 120 dakika boyunca aktarın. Lekeleme tamamlandıktan sonra, zarı TBST'de% 7'lik yağsız kuru süt bloke edici bir çözeltiye yerleştirin ve 20 dakika boyunca inkübe edin.
Bundan sonra, pirinç cüce virüsü P8 veya vitellogenine karşı bir antikor ekleyin ve zarı iki saat veya gece boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, membranı TBST ile üç kez yıkayın ve her yıkama arasında beş dakikalık bir inkübasyon yapın. Daha sonra ikincil bir antikor olarak Goat anti-Rabbit IgG ekleyin ve zarı 60 ila 90 dakika boyunca inkübe edin.
Kitteki bir ve iki karışık algılama reaktiflerinde bire bir oranında kemilüminesan algılama için ECL Western kitini kullanın. Membranı karışık reaktife koyun ve lekeyi beş dakika boyunca inkübe edin. Fazla reaktifi boşaltın ve membranın kemilüminesan ve kolorimetrik bir resmini çekin.
İkincisini protein bantlarıyla görmek için resimleri birleştirin. Vitellogeninin tespiti için Batı leke analizi, pirinç bitkilerinin beslenmesinde ve böceklerin tükürük bezlerinde yaklaşık 220 kilodaltonluk spesifik ve beklenen bantlar göstermiştir. Buna karşılık, beslenmeyen bitkilerde hiçbir bant gözlenmemiştir, bu da vitellogeninin bitki konakçısında tükürük proteini olarak salındığını göstermektedir.
Pirinç cüce virüsü P8 proteininin tespiti için yapılan Western leke analizi, besleme bitkilerinde ve virülifer böcek gövdelerinde yaklaşık 46 kilodaltonluk spesifik ve beklenen bir bant göstermiştir. Buna karşılık, beslenmeyen bitkilerde ve virülifer olmayan yaprak haznesi gövdelerinde hiçbir bant gözlenmemiştir, bu da viral proteinlerin besleme bitkilerinde de tespit edilebileceğini kanıtlamıştır. Bu protokol uygulanırken yaprakçıklardaki viral yükleme, tespit zamanlaması ve replikalar dikkate alınmalıdır.
Bu yöntem, arbovirüsleri ileten sivrisinekleri incelemek için de uygulanabilir.
