Bu video, tümör kaynaklı hücre dışı veziküllerin veya EV'lerin in vivo immünojenisitesinin akış sitometrisi kullanılarak nasıl değerlendirileceğini göstermektedir. Burada açıklanan tarama yönteminin gerçekleştirilmesi nispeten kolaydır ve çeşitli ayarlara uyarlanabilir. Kanserde, immünojenik hücre dışı vezikül koşullarının belirlenmesi, belirli translasyonel alaka düzeyine sahiptir.
Bu nedenle, otolog EV'ler kişiselleştirilmiş anti-kanser tedavileri olarak kullanılabilir. Prosedürün ilk bölümünü gösteren, laboratuvarımdan teknik asistan Tatiana Nedelko olacak. Hücre dışı vezikül veya EV'ler için gerekli hücre kültürü ortamının hazırlanmasına başlamak için, FCS ortamındaki sığır EV'lerini, 4 santigrat derecede 24 saat boyunca 100.000 kez g'de ultrasantrifüjleme yoluyla tüketin.
Santrifüjlemeden sonra peleti atın. Ovalbümin eksprese eden murin B16 melanom hücrelerini veya B16-OVA hücrelerini kültürden toplayın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri EV-tükenmiş ortamda mililitre başına 400.000 hücre konsantrasyonunda tohumlayın.
Daha sonra, B16-OVA hücrelerine mililitre başına 30 mikrogram oksaliplatin uygulayın ve işlenmemiş kontrol numuneleriyle 37 santigrat derecede 24 saat boyunca inkübe edin. 24 saat sonra, süpernatantı 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 400 kez g'de santrifüje toplayın. Pelet, 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca 2.000 kez g'de tekrar santrifüjlemeden önce atın.
Peleti attıktan sonra, süpernatantı 220 nanometre PVDF membran filtresinden taze bir tüpe süzün. Daha sonra, 1 mililitre süpernatantı 0.5 mililitre ticari olarak temin edilebilen belirli bir eksozom izolasyon reaktifi ile karıştırın. Vorteks yapın ve karışımı 1,5 mililitrelik tüplere aktarın, ardından 4 santigrat derecede gece boyunca inkübasyon.
Ertesi gün, karışımı 4 santigrat derecede 60 dakika boyunca 10.000 kez g'de santrifüj edin. Süper natantı dikkatlice attıktan sonra, 1,5 mililitrelik tüpü bir kağıt havlu üzerinde baş aşağı vurarak ve alttaki EV peletine dokunmadan ince bir pipet ucundan aspirasyon yaparak kalan damlaları çıkarın. Peletin ucu ile çizilmeden yukarı ve aşağı pipetle pipetlenerek soğuk PBS'de peleti yeniden askıya alın.
Ardından, EV'leri tüm tüplerden toplayın. Hemen kullanmıyorsanız, EV süspansiyonlarını uygulamaya kadar 28 güne kadar silikonize kaplarda 80 santigrat derecede saklayın. Tedavi grubundaki her fareyi 4.0 x 10'dan beşinci B16-OVA hücrelerine izole edilmiş EV'lerle aşılamak için, 5 mikrolitre EV süspansiyonunu 55 mikrolitre soğuk PBS ile karıştırın.
Daha sonra, 26 ila 30 gauge iğne ile monte edilmiş şırıngaları 60 mikrolitre seyreltilmiş EV veya PBS ile doldurun ve ardından şırıngayı hemen buza koyun. EV'leri veya PBS'yi deri altından farelerin uyluğunun medial yönüne aşılayın. Yedi gün sonra bağışıklamayı tekrarlayın.
İlk tedaviden 14 gün sonra, dalağı rezeke etmek için fareleri feda edin. Daha sonra, rezeke edilmiş dalağı nemlendirilmiş 100 mikrometre hücre süzgeci ve bir şırınganın plastik pistonu ile ezin. Dalak hücrelerini, 5 ila 10 mililitre serin tam RPMI ile 50 mililitrelik bir tüpe yıkayın.
Daha sonra, süpernatanı atmadan önce hücreleri 400 kez g'de 4 santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin. Eritrositleri hücre süspansiyonundan çıkarmak için, hücre peletini oda sıcaklığında beş dakika boyunca 2 mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile yeniden askıya alın ve inkübe edin. Ardından, beş ila 10 mililitre tam RPMI ekleyerek reaksiyonu durdurun, ardından daha önce açıklandığı gibi santrifüjleme yapın.
Hücre peletini tam RPMI'da yeniden askıya aldıktan sonra, her fareden hücreleri sayın ve 200 mikrolitre cRPMI ile 200.000 splenositin üçlüsünü, U şeklinde bir tabana sahip 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna yerleştirin. Ardından, plakaları 37 santigrat derecede 48 saat boyunca kuluçkaya yatırın. 48 saat sonra, hücre kültürünü mililitre Brefeldin A başına 5 nanogram, mililitre PMA başına 20 nanogram ve mililitre İyonomisin başına 1 mikrogram ile 4 saat boyunca 37 santigrat derecede tedavi edin.
Kuluçka sonrası, plenositleri V şeklinde bir tabana sahip 96 delikli bir plakaya aktarın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Pelet edilmiş plenositleri taze hazırlanmış boyama çözeltisinde yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu ışıktan korunan 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Fiksasyon ve geçirgenlik için, FACS-tamponunda iki kez yıkayın ve daha sonra plenositleri, fiksasyon ve geçirgenlik çözeltisinin kuyucuğu başına 100 mikrolitre içinde yeniden askıya alın, ardından daha önce açıklandığı gibi karanlıkta inkübasyon.
Hücre içi interferon gamayı boyamak için, hücreleri tamponda 1:200 seyreltilmiş interferon gamaya karşı floresan antikorlarla tekrar göndermeden önce plenositleri fiksasyon veya permeabilizasyon tamponunda yıkayın. Splenositleri karanlıkta 4 santigrat derecede 1 ila 12 saat boyunca inkübe edin. FACS-tamponunda kapsamlı yıkama ve resüsitasyondan sonra, makalede açıklanan geçit stratejisine göre sitotoksik T hücrelerinin aktivasyonunu analiz edin.
Temsili görüntüde, sitotoksik T hücrelerinin aktivasyonunu analiz etmek için geçit stratejisi gösterilmektedir. Hücreler tek hücreler, lenfosit alt kümesi, canlı CD3-pozitif T hücreleri ve CD4-negatif CD8-pozitif sitotoksik T hücreleri olarak kapılıydı. İnterferon gamanın hücre içi birikimi, aktivasyon için vekil bir belirteç olarak değerlendirildi.
Tümör hücrelerinden türetilen EV'lerle bağışıklamadan sonra, alıcı farelerde antijene özgü T hücresi yanıtlarının indüksiyonu incelenmiştir. Oksaliplatin tedavisi gibi genotoksik stres koşulları altında kültürlenen tümör kaynaklı EV'ler, tedavi edilmemiş EV'lerin aksine, dalak sitotoksik T hücrelerinin güçlü aktivasyonunu indükledi. Araçla tedavi edilen hayvan grubu en düşük yanıtı gösterdi.
Dalak T hücrelerinin aktivasyonu, ovalbümin varlığında veya yokluğunda ex vivo restimüle edildikten sonra belirlendi. İnterferon gama üretimi, tümör EV ile tedavi edilen hayvanların plenositleri, analizden önce model tümör antijeni ovalbümin ile yeniden uyarıldığında artmıştır. Tekrarlanabilir sonuçların EV'lerin sürekli izolasyon etkinliğine dayandığını lütfen unutmayın.
Bu nedenle, kurumayı önlemek için EV peletlerinin tamamen ve derhal yeniden askıya alındığından emin olun. Bu protokolle, tümör hücresi kaynaklı EV'lerin immünojenisitesini belirleyen tümör hücreleri içindeki spesifik yolları analiz edebildik. Bu, kanser tedavisinde bu tür immünojenik EV'lerden yararlanmanın yolunu açabilir.
