Dieses Video zeigt, wie die In-vivo-Immunogenität von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln oder EVs mittels Durchflusszytometrie beurteilt werden kann. Das hierin beschriebene Screening-Verfahren ist relativ einfach durchzuführen und kann an verschiedene Einstellungen angepasst werden. Bei Krebs wird die Identifizierung von Zuständen immunogener extrazellulärer Vesikel von besonderer translationaler Relevanz freigesetzt.
Daher könnten autologe Elektrofahrzeuge als personalisierte Krebsbehandlungen eingesetzt werden. Den ersten Teil des Verfahrens wird Tatiana Nedelko, eine technische Assistentin aus meinem Labor, demonstrieren. Um mit der Herstellung von Zellkulturmedien zu beginnen, die für extrazelluläre Vesikel oder EVs benötigt werden, erschöpfen Sie die Rinder-EVs in FCS-Medien durch Ultrazentrifugation bei 100.000 mal g für 24 Stunden bei 4 Grad Celsius.
Entsorgen Sie das Pellet nach der Zentrifugation. Ernten Sie die murinen B16-Melanomzellen, die Ovalbumin oder B16-OVA-Zellen exprimieren, aus der Kultur und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Dann säen Sie die Zellen in einer Konzentration von 400.000 Zellen pro Milliliter in den EV-erschöpften Medien.
Als nächstes behandeln Sie die B16-OVA-Zellen mit 30 Mikrogramm Oxaliplatin pro Milliliter und inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit unbehandelten Kontrollproben. Nach 24 Stunden den Überstand sammeln, um bei 400 mal g für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren. Entsorgen Sie das Pellet vor der Zentrifugation erneut bei 2.000 mal g für 30 Minuten bei 4 Grad Celsius.
Filtern Sie nach dem Auswerfen des Pellets den Überstand durch einen 220 Nanometer großen PVDF-Membranfilter in ein frisches Rohr. Mischen Sie dann 1 Milliliter Überstand mit 0,5 Millilitern eines bestimmten kommerziell erhältlichen Exosom-Isolationsreagenzes. Wirbeln Sie vor und geben Sie die Mischung in 1,5-Milliliter-Röhrchen, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 4 Grad Celsius.
Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Mischung bei 10.000 mal g für 60 Minuten bei 4 Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand vorsichtig entsorgt haben, entfernen Sie die verbleibenden Tropfen, indem Sie das 1,5-Milliliter-Rohr kopfüber auf ein Papiertuch klopfen und durch eine feine Pipettespitze absaugen, ohne das EV-Pellet am Boden zu berühren. Resuspendieren Sie das Pellet in kaltem PBS, indem Sie es auf und ab pipettieren, ohne das Pellet mit der Spitze zu zerkratzen.
Bündeln Sie dann die EVs aus allen Röhren. Wenn Sie sie nicht sofort verwenden, lagern Sie die EV-Suspensionen bei 80 Grad Celsius in silikonisierten Gefäßen bis zu 28 Tage bis zur Anwendung. Um jede Maus in der Behandlungsgruppe mit EVs zu immunisieren, die von 4,0 x 10 bis zu den fünften B16-OVA-Zellen isoliert wurden, mischen Sie 5 Mikroliter der EV-Suspension mit 55 Mikrolitern kaltem PBS.
Als nächstes füllen Sie Spritzen, die mit 26- bis 30-Gauge-Nadeln montiert sind, mit 60 Mikrolitern der verdünnten EVs oder PBS und legen Sie die Spritze dann sofort auf Eis. Impfen Sie die EVs oder PBS subkutan in den medialen Aspekt des Oberschenkels der Mäuse. Wiederholen Sie die Immunisierung nach sieben Tagen.
14 Tage nach der ersten Behandlung opfern Sie die Mäuse, um die Milz zu resezieren. Dann zerdrücken Sie die resezierte Milz mit einem angefeuchteten 100-Mikrometer-Zellsieb und dem Kunststoffkolben einer Spritze. Spülen Sie die Milzzellen in ein 50-Milliliter-Rohr mit 5 bis 10 Millilitern des kühlen kompletten RPMI.
Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 mal g für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius, bevor Sie den Überstand verwerfen. Um Erythrozyten aus der Zellsuspension zu entfernen, resuspendieren und inkubieren Sie das Zellpellet mit 2 Millilitern des Lysepuffers der roten Blutkörperchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Stoppen Sie dann die Reaktion, indem Sie fünf bis 10 Milliliter vollständiges RPMI hinzufügen, gefolgt von einer Zentrifugation, wie zuvor beschrieben.
Nachdem Sie das Zellpellet in vollständigem RPMI resuspendiert haben, zählen Sie die Zellen von jeder Maus und legen Sie die Triplikatoren von 200.000 Splenozykten mit 200 Mikrolitern cRPMI in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit einem U-förmigen Boden. Dann inkubieren Sie die Platten für 48 Stunden bei 37 Grad Celsius. Nach 48 Stunden behandeln Sie die Zellkultur mit 5 Nanogramm pro Milliliter Brefeldin A, 20 Nanogramm pro Milliliter PMA und 1 Mikrogramm pro Milliliter Ionomycin bei 37 Grad Celsius für 4 Stunden.
Nach der Inkubation die Splenozyten auf eine 96-Well-Platte mit einem V-förmigen Boden übertragen und die Zellen zweimal mit PBS waschen. Die pelletierten Splenozyten werden in der frisch zubereiteten Färbelösung resuspendiert und die Zellsuspension 30 Minuten lang bei 4 Grad Celsius lichtgeschützt inkubiert. Zur Fixierung und Permeabilisierung die Splenozyten zweimal im FACS-Puffer waschen und dann die Splenozyten in 100 Mikrolitern pro Vertiefung der Fixations- und Permeabilisierungslösung resuspendieren, gefolgt von einer Inkubation im Dunkeln, wie zuvor erläutert.
Um das intrazelluläre Interferon gamma zu färben, waschen Sie die Splenozyten im Fixations- oder Permeabilisierungspuffer, bevor Sie die Zellen mit den fluoreszierenden Antikörpern gegen Interferon gamma verdünnt 1:200 im Puffer erneut senden. Inkubieren Sie die Splenozyten für 1 bis 12 Stunden bei 4 Grad Celsius im Dunkeln. Nach gründlichem Waschen und Resuspension im FACS-Puffer analysieren Sie die Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen gemäß der im Manuskript erläuterten Gating-Strategie.
Im repräsentativen Bild ist die Gating-Strategie zur Analyse der Aktivierung zytotoxischer T-Zellen dargestellt. Die Zellen wurden als einzelne Zellen, die Lymphozyten-Untergruppe, die lebensfähigen CD3-positiven T-Zellen und die CD4-negativen CD8-positiven zytotoxischen T-Zellen eingezäunt. Die intrazelluläre Akkumulation des Interferon-Gammas wurde als Surrogatmarker für die Aktivierung bewertet.
Nach der Immunisierung mit EVs aus den Tumorzellen wurde die Induktion von antigenspezifischen T-Zell-Reaktionen bei Empfängermäusen untersucht. Die tumorabgeleiteten EVs, die unter genotoxischen Stressbedingungen wie der Oxaliplatinbehandlung kultiviert wurden, induzierten im Gegensatz zu unbehandelten EVs eine starke Aktivierung der splenischen zytotoxischen T-Zellen. Die fahrzeugbehandelte Tiergruppe zeigte die geringste Reaktion.
Die Aktivierung von Milz-T-Zellen wurde nach der Ex-vivo-Restimulation entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von Ovalbumin bestimmt. Die Produktion des Interferon-Gammas war erhöht, wenn die Splenozyten von Tumor-EV-behandelten Tieren vor der Analyse mit dem Modell-Tumorantigen Ovalbumin restimuliert wurden. Bitte beachten Sie, dass reproduzierbare Ergebnisse von der konstanten Isolationswirksamkeit von Elektrofahrzeugen abhängen.
Stellen Sie daher sicher, dass EV-Pellets vollständig und zeitnah resuspendiert werden, um eine Austrocknung zu vermeiden. Mit diesem Protokoll konnten wir spezifische Signalwege innerhalb von Tumorzellen analysieren, die die Immunogenität von von Tumorzellen abgeleiteten EVs bestimmen. Dies könnte den Weg ebnen, um solche immunogenen EVs in der Krebsbehandlung zu nutzen.
