Bu protokol, çok çeşitli hücresel süreçleri anlamak için gerekli olan protein konformasyonsal dinamiklerinin tespiti ve karakterizasyonu için kullanılabilir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem özel numune hazırlama adımları gerektirmez ve kinetiğin, termodinamiğin ve teyit dengesinin yapısal yönlerinin kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesini sağlar. CPMG gevşeme dağılımı, nükleik asitlerde ve diğer biyomoleküllerde onay dinamiklerinin karakterizasyonu ve ligand nanopartikül etkileşimlerinin karakterizasyonu için daha yaygın olarak uygulanabilir.
Protokolümüz ilk kez CPMG kullanıcılarına yöneliktir. Bu yüzden iyi bir başlangıç noktası. Ancak, kullanıcıların geleneksel NMR denemelerini çalıştırmak için temel adımları bilmelerini bekliyoruz.
İlk kez bir NMR denemesi ayarlamak için, önce bu ek dosyaları indirin ve ferşimi çözün. Bitleri kopyalayın. vv ve trosy_15N_CPMG.
vv dosyaları darbe programı klasöründe darbe programı dizinine. Edinme yazılımını açın ve daha önce çalıştırılan bir hidrojen nitrojen 15 HSQC deneyini yeni bir deneye kopyalamak için EDC komutunu kullanın. trosy_15N_CPMG yüklemek için pulse program komutunu kullanın.
vv pulse program dosyasını yeni oluşturulan deneye alın. Ardından, CPMG denemesini ayarlamak için darbe programı dosyasının sonundaki yönergeleri kullanın. Rutin bir NMR denemesi ayarlamak için, örneği mıknatısla tanıtın ve tüm temel NMR edinme adımlarını gerçekleştirin.
P1'i hidrojen sert 90 derece darbe süresine ve P7'yi azot 15 sert 90 derece darbe süresine ayarlayın. Edinme penceresinde, hidrojen ve azot 15 boyutları için merkez ve spektral genişliği ayarlayın. Gevşeme gecikmesini 0.7 T2 olarak ayarlayın ve VC listesi komutunu kullanarak N'ye karşılık gelen tamsayı numaralarının bir listesini oluşturun.Listedeki her girişin, dosyalanan CPMG'ye göre farklı bir BGBMG alanına karşılık geldiğini onayladıktan sonra, D30'a bölünen 4N'ye eşittir, listedeki ilk sayının sıfır olup olmadığını kontrol edin.
L8'i VC listesindeki girdi sayısına, L3'ü dolaylı boyut için gerçek nokta sayısına ve 1TD'yi L8 çarpı L3 çarpı ikiye ayarlayın. Su bastırmayı optimize etmek için, alıcı kazancını bire ayarlayın ve darbe programı dosyasını açmak için EDC çekme yazın. 91. satırda, goto 999'dan önceki nokta üst üste işareti kaldırın ve dosyayı kaydedin.
GS komutunu kullanarak, FID sinyalinin yoğunluğunu en aza indirmek için SPDB0 parametrelerini ayarlayın. Sinyal yoğunluğu değiştirildiğinde, darbe programı dosyasının 91. SPDB11'i en iyi duruma getirmek için, alıcı kazancını bire ve darbe programı dosyasını açmak için EDC çekme türünü ayarlayın.
168. satırda, goto 999'dan önceki nokta üst üste işareti kaldırın ve dosyayı kaydedin. GS komutunu kullanarak, FID sinyalinin yoğunluğunu en aza indirmek için SPDB11 parametrelerini ayarlayın. Sinyal yoğunluğu değiştirildiğinde, yarı iki nokta üst üsteyi satır 168'e yeniden girin ve dosyayı kaydedin.
SPDB2'yi en iyi duruma getirmek için alıcı kazancını bire ayarlayın ve darbe programı dosyasını açmak için EDC çekme girin. 179. satırda, goto 999'dan önceki nokta üst üste işareti kaldırın ve dosyayı kaydedin. GS komutunu kullanarak, FID sinyalinin yoğunluğunu en aza indirmek için SPDB2 parametrelerini ayarlayın.
Sinyal yoğunluğu değiştirildiğinde, darbe programı dosyasının 179 numaralı satırında noktalı virgülü yeniden tanıtın ve dosyayı kaydedin. PLDB2'yi optimize etmek için alıcı kazancını bire ayarlayın ve darbe programı dosyasını açmak için EDC çekin girin. 184. satırda, goto 999'dan önceki nokta üst üsteyi kaldırın ve dosyayı kaydedin.
GS komutunu kullanarak, FID sinyalinin yoğunluğunu en aza indirmek için PLDB2 parametrelerini ayarlayın. Sinyal yoğunluğu değiştirildiğinde, darbe programı dosyasının 184 numaralı satırında noktalı virgülü yeniden girin ve dosyayı kaydedin. Alıcı kazancını en iyi duruma getirmek için RGA komutunu çalıştırın.
Ardından denemeyi başlatmak için ZG komutunu çalıştırın. Bu şekilde, hidrojen nitrojen 15 Trosy spektrumundaki her tepe için elde edilen gevşeme dispersiyon profillerinin sonuçları gözlemlenebilir. Elde edilen gevşeme dispersiyon profillerinden, her omurga AMI grubunun azot 15 enine gevşemesine değişim katkısını tahmin etmek mümkündür.
Araştırılan proteinin 3B yapısındaki enine gevşemeyi çizerek, mikrosaniye milisaniyelik zaman ölçeğinde onay değişiminden geçen yapısal bölgeleri belirlemek mümkündür. Carver-Richards denklemleri kullanılarak gevşeme dağılım eğrilerinin modellanması, dengedeki devletlerin kesirli popülasyonları ve bu durumlar arasındaki değişim oranı gibi değişim sürecindeki termodinamik ve kinetik parametreleri döndürür. Bu termodinamik ve kinetik parametrelerin sıcaklık bağımlılığı, teyit değişiminin enerjileri hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için sırasıyla van't Hoff ve I-ring denklemleri kullanılarak modellenebilir.
Tüm alım parametrelerini, özellikle de P7'yi dikkatlice optimize etmek çok önemlidir. Sahte dağılımları önlemek için son derece saf ve homojen numuneler üretmek de önemlidir. Bu protokol kullanılarak elde edilen kinetik, termodinamik ve kimyasal çip parametreleri, onay değişiminden geçen türler hakkında enerjik ve yapısal bilgi elde etmek için kullanılabilir. CPMG yöntemleri ile elde edilen protein onay dinamiklerinin karakterizasyonu, sinyalizasyon ve enzimatik aktiviteyi anlamanın yanı sıra ilaç tasarımı için yeni bakış açıları konusunda çok önemli bilgiler sağlar.
