Uzun dalga boyu makromoleküler kristalografi, proteinlerde ve nükleik asitlerde doğal olarak bulunan ışık atomlarından gelen anormal sinyali sömürür. Bu teknik, kristalografik yüz problemini deneysel olarak çözmek ve bu elementlerin kimliğini ve yerini belirlemek için kullanılır. Diamond Light Source'daki Beamline I23, beş angstroma kadar uzun dalga boylarındaki deneyler için optimize edilmiş benzersiz bir senkrotron cihazıdır.
Kalsiyum, potasyum, klor, kükürt ve fosfor gibi yüksek biyolojik alaka düzeyine sahip elementlerin emilim kenarlarına erişim sağlar. Uzun dalga boyu rejiminde x ışınlarının hava yoluyla önemli ölçüde emilimi nedeniyle bu deneyler vakum ortamında yapılmaktadır. Numuneleri vakum ortamında kriyojenik sıcaklıklarda tutmak için kristaller özel, termal iletken numune tutuculara monte edilir.
Sıvı azottan vakum uç istasyonuna kriyojenik numune transferi kriyo-elektron mikroskopisinde kullanılan tekniklere çok benzer. Bu protokol, Diamond Light Source'da geliştirilen araç ve gereçleri kullanarak kristallerin vakum ortamına aktarılması prosedürünü sunar. Kapağı CombiPuck'ın tabanından ayırarak başlayın, böylece numune tutucular tabana bağlı kalır ve şişeler kapakta tutulur.
Kapağı sıvı nitrojene şişelerle batırın, ardından bir numune tutucu ve adaptörü manyetik bir değnek takın ve kristalleri hasat edin. Her numuneyi doğrudan CombiPuck'a soğuyun ve numune konumunu not edin. Pakı kapatmak için, tabanı kapağına tutturmak için bir pak değneği kullanın.
CombiPuck'ı sıvı nitrojenden kuru göndericiye veya depolamaya aktarın. Boş transfer bloklarıyla doldurulmuş blok pakının tabanını bir köpük kaptaki destek tabanına yerleştirin, ardından sıvı nitrojenle doldurun. Daha sonra, CombiPuck'ı sıvı nitrojenle dolu köpük kaba yerleştirin, pakın tabanının köpük kabın içindeki manyetik tutucuya sabit olduğundan emin olun.
Sıvı nitrojende gerekli tüm aletleri önceden soğutur. Daha sonra, kapağı yüksek ayardaki pak ayırıcı aracını kullanarak tabandan ayırın, böylece taban manyetik tutucuya bağlı kalır ve numune tutucuları sıvı nitrojenin içine maruz kalır. Ayırıcı değneği numune tutucusuna ve adaptörün üzerine olabildiğince aşağı yerleştirin ve asanın dikey olduğundan emin olun.
Ayırıcı değnekteki küçük kolu, numune tutucuyu içeride sabitlemek için tıklayana kadar başparmağınızla aşağı hareket ettirin ve numune tutucuyu adaptörden çekin. Ayırıcıyı istediğiniz transfer bloğu konumuna düşürün, üç uçlardan birinin transfer bloğunun merkezi deliğine sığmasını sağlar. Kolu tekrar yukarı hareket ettirerek numune tutucuyu serbest bırakın.
Örnekleri bir sonraki aktarım bloğuna yüklemek için, boş bir aktarım bloğunu yatay konuma döndürmek için dönen atlıkarınca anahtar aracını kullanın. Tüm numune tutucular transfer edildikten sonra, kapağı sıvı nitrojene yerleştirerek blok pakını kapatın. Sıcaklığın dengelemesini bekleyin ve ardından kapağı tabanın üzerine takın ve atlıkarıncadan serbest bırakmak için hafifçe kaldırın.
Mekiği istasyona bağlayın. Azot gazı ve hava vanalarını açın ve gazların aktığından emin olun. Ardından CTS'yi kapatın.
Hem banyoyu hem de mekiği sıvı nitrojenle soğutun. Birlikte verilen huniyi mekik üzerindeki dolum portuna yerleştirin ve ekrandaki seviyeyi izlerken huninin içine yavaşça sıvı azot dökün. Gösterge kırmızıdan maviye döndüğünde durun.
Huniyi kullanarak banyoyu sıvı nitrojenle doldurun. Bir blok pakı sıvı azottan CTS banyosuna ekli pak ayırıcı aracını kullanarak aktarın. Blok pakın kapağını çıkarın ve CTS banyosunun kapağını kapatın.
Mekiğe bir transfer bloğu tanıtmak için, mekik kolunu saat yönünde 90 derece döndürerek kilidini açın ve tutamak üzerindeki kılavuzlu parçanın doğru seyahat yolunu zorlaması için banyoya doğru ilerletin. Blok kapağı soğuduktan sonra, bloğu mekiğe sokmak için tutamağı ilerletin. Aktarım bloğunu mekik üzerine kilitlemek için tutamacı saat yönünde 180 derece döndürün.
Tutamacı orijinal arka konuma geri çek ve saat yönünün tersine 90 derece döndürerek yerine kilitleyin. Mekik tahliyesine başlamak için ekran ekranında Mekik Vana Pompasını Kapat'a basın. Mesajlar Mekik hareket etmeye hazır olduğunda ve Çubuğu hareket ettirmeyin, valf kapalı dokunmatik ekranda görüntülenir, mekiğin altındaki kola basın ve üstteki kolu kullanarak dikkatlice kaldırın.
Mekiği vakum uç istasyonundaki hava kilidine dik bir konumda taşıyın ve takın. Dokunmatik ekrandaki ilgili düğmeye basarak ve örnek oteli doğru yükleme konumuna taşıyarak kap içinde boş bir blok konumu seçin. Örnek bir otel yer aldıktan sonra, vakum kilitleme sırasını başlatmak için Aç düğmesine basın.
Sıra tamamlandıktan ve durum Airlock açık olarak değiştikten sonra, mekikte blok, çubuğun kilidini açmak için kolu saat yönünde 90 derece bükün. Çubuğu yavaşça gemiye itin, böylece kılavuzlu parça örnek otele doğru seyahat yolunu zorlar. Kılavuz için ekranda görüntülenen video akışını kullanarak aktarım bloğunu yavaşça otele yerleştirin ve dokunmatik ekrandaki blok konumu simgesinin etkinleştirildiğinden emin olma.
Etkinleştirildikten sonra, aktarım bloğunu serbest bırakmak ve çubuğu gemiden çıkarmak için kolu saat yönünün tersine 180 derece döndürün. Tamamen geri çekildikten sonra, çubuğu kilitlemek için kolu saat yönünün tersine 90 derece döndürün. Son istasyon vakum vanasını kapatmak ve mekik ile gemi arasındaki boşluğu atmosferik basınca boşaltmak için Kapat düğmesine basın.
Hava kilidi ekranı ayırmak için Tamam durumunu gösterdiğinde mekiği çıkarın. Mekiği CTS banyosuna geri döndürün ve bir sonraki örnek bloğu yüklemeden önce mekiği tahliye etmek için Açık Mekik Vanası'na basın. Trafik ışığı yeşil olduğunda ve çubuğu taşımak için Tamam mesajı göründüğünde, bir sonraki aktarım bloğu mekiğe tanıtılabilir.
Bir sonraki transfer bloğunu hazırlamak için, blok pakını banyonun içinde döndürün. Akrilik kapağın üstündeki yerleşik döndürme tuşunu blok pakın ortasındaki kilidin içine itin. Basılı tutarken, istediğiniz transfer bloğunu teslim alma konumuna getirmek için anahtarı çevirin.
Tüm bloklar aktarıldıktan sonra, mekik vanasının açık olduğundan emin olun, dokunmatik ekrandaki Bake düğmesine basın, hem Banyo hem de Mekik'i seçin ve ardından Başlat Bake'ye basın. Diamond Light Source'daki uzun dalga boyu makromoleküler kristalografi kiriş çizgisi I23, kalsiyum, potasyum, klor, kükürt ve fosfor gibi biyolojik önemi yüksek elementlerin emilim kenarlarına erişebilir ve bu elementlerin makromoleküller içinde fazlanması veya bulunması için kullanılabilecek gelişmiş anormal sinyal verir. Kırınım verileri, dalga boyu 2.75 angstrom'daki tek bir thaumatin kristalinden toplanmış, daha uzun dalga boylarında artan anormal sinyal ve numune emilim etkileri arasında bir uzlaşma olarak seçilmiştir.
Vakum kurulumu, sadece numune tarafından saçılan x ışınlarının dedektöre ulaşmasını sağlayarak Bragg yansımalarının etrafında düşük arka plan sağlar. Veri kümesi çok güçlü anormal sinyal verdi ve otomatik fazlama ardışık düzeni CRANK2 ile yapı çözümünü kolaylaştırdı. Elde eden elektron yoğunluk haritasının yüksek kalitesi, thaumatin amino asit dizisinin% 100'ü için doğru yerleştirme ile başarılı otomatik model oluşturmayı sağladı.
Thaumatin içindeki 16 sistein kalıntısı, elektron yoğunluk haritasında açıkça görülebilen sekiz disülfid köprü oluşturur. Vakum içi uzun dalga boyu protein kristalografisi yeni bir alan olduğundan, yeni numune taşıma araçları ve ekipmanları geliştirdik. Bu protokol, Diamond Light Source'daki I23 beamline'daki vakum uç istasyonuna güvenli bir şekilde numune aktarma konusunda kullanıcılara rehberlik eder.
Vakum ortamı, diğer kiriş hatlarında erişilemeyen bir dalga boyu aralığında kırınım deneyleri yapmak için benzersiz fırsatlar sunar. Uzun dalga boyundaki x-ışını kristalografisi, makromoleküllerin doğrudan doğal kristallerden deneysel olarak aşamasını sağlar. Ayrıca moleküllere bağlı iyonların kesin olarak tanımlanmasına izin verir.
