Bu protokol, donör söndürme ve alıcı duyarlılaştırılmış emisyon kullanarak FRET'yi ölçmek için adım adım deneysel bir süreç ve matematiksel algoritmayı açıklar. Canlı hücredeki FRET verimliliklerinin miktarının belirlenmesi, floresan proteinlerinin çapraz etkileşiminin ve mikroskobik kurulumdaki floroforların göreceli emisyon ve algılama verimliliklerinin belirlenmesini gerektirir. Crosstalk, sadece bir florofor eksprese eden görüntüleme hücreleri ile değerlendirilebilir.
Bir donörün veya bir alıcı molekülün tespit verimliliğinin değerlendirilmesi, ölçüm sinyaline yol açan donör ve alıcı moleküllerin sayısının oranının bilinmesini gerektirir. Canlı hücrelerde eksprese edilen floroforların sayısı hücreden hücreye değişir ve bilinmemektedir. Bu yöntemde kullanılan kalibrasyon probu, bire bir donör-alıcı füzyon proteini, donör ve alıcı moleküllerin göreceli tespit verimliliğini belirlemeyi mümkün kılar.
Başlamak için, EGFP mCherry 1 füzyon probunu üretmek için mCherry 1 ile bir N1 memeli hücre ekspresyon vektörü kullanın. Bir hücre bir BAM h1 parçası olarak bir durdurma kodonu olmadan EGFP'yi yükseltmek için oligonükleotidler tasarlayın. Yeşil ve kırmızı floresan protein arasındaki beş amino asit bağlayıcısı, GFP kiraz donör-alıcı çifti için 0.25 ila 0.3 arasında ortalama bir FRET eksikliği vermelidir.
Arka plan floresansını azaltmak için fenol kırmızısı olmadan herhangi bir hücre çizgisi ve ortam kullanın. Hücreler% 80 birleştiğinde, bunları bir mililitre% 0.05 tripsin EDTA ile ayırın ve beş mililitrelik bir hücre süspansiyonundan üç damla ekleyerek sekiz delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna yaklaşık 10.000 hücre tohumlayın. Kaplamadan 24 saat sonra, uygun bir transfeksiyon ortamı kullanarak hücreleri transfekte edin.
Uygun floresan protein ekspresyonuna, katlanmaya ve olgunlaşmaya izin vermek için canlı hücre görüntülemeden önce hücreleri 20 saat boyunca inkübe edin. Nemlendirilmiş ve ısıtılmış bir çevre odasındaki hücreleri, konfokal tarama mikroskobu ile 37 santigrat derecede görüntüleyin. Hücre ortamını fizyolojik pH'ta tamponlamak için, hücre ortamını karbondioksitten bağımsız hale getirmek için 20 milimolar HEPES ekleyin.
Ardından slaytı mikroskopa monte edin. GFP'yi heyecanlandırmak için argon iyon lazerinin 488 nanometre çizgisini ve kirazı heyecanlandırmak için 561 nanometre diyot lazerini kullanın. 488 nanometre lazeri, 505 ila 530 nanometrelik bir emisyon bandı aracılığıyla birinci kanalda ve 585 nanometrenin üzerinde uzun geçiş filtresiyle ikinci kanalda uyarma için ayarlayın.
585 nanometrenin üzerinde uzun geçiş filtresiyle üçüncü kanalda uyarma için 561 nanometre lazeri kullanın. İki lazeri sırayla uyarın ve görüntüleme modunu her satırdan sonra değişecek şekilde ayarlayın, böylece 512 x 512 piksel görüntünün uyarılması her satırdan sonra değişir. Önemli fotobeyazlatma meydana gelip gelmediğini tespit etmek ve gerekirse lazer gücünü azaltmak için üç görüntüden oluşan mini bir zaman serisi ayarlayın.
İlk olarak, GFP kiraz füzyon yapısını ifade eden görüntü hücreleri. Konfokal görüntüde piksel başına zamana entegre lazer yoğunluğunu tanımlayan parametreleri ayarlayın. 63X yağ hedefi kullanın ve bir hücreyi tamamını yeterli büyütme ve çözünürlükle görüntülemek için 3X'e ayarlayın.
70 ila 80 nanometrelik bir piksel boyutunu hedefleyin. Piksel bekleme süresini iki ila dört mikrosaniyeye ve 488 nanometre ve 561 nanometre lazer için AOTF iletimine ayarlayın, böylece görüntüler herhangi bir ağartma olmadan iyi bir sinyal-gürültü oranı gösterir ve floresan yoğunluğu doygunluğunu gösteren piksel yoktur. 488 ve 561'in lazer gücünü, birinci ve üçüncü kanaldaki sinyal seviyeleri benzer olacak şekilde ayarlayın.
Fotoğraf çarpanı kazancını 600 ila 800 olarak ayarlayın. Resim 15 ila 20 GFP kiraz füzyon proteinini eksprese eden hücreler, GFP, kiraz, GFP ve kirazı eksprese eden hücreler ve transekte olmayan hücreler. Daha sonra, ilgilenilen proteinleri birlikte ifade eden görüntü hücreleri, sırasıyla GFP ve kiraz ile birleşti.
FRET'i hesaplamak için, birinci kanaldaki donör sinyalini, 488 nanometre uyarımlı donör kanalını ve 505 ila 530 nanometrelik bir emisyon bandını ölçün. Daha sonra alıcı sinyalini üçüncü kanalda, alıcı kanalda 561 nanometre uyarım ve 585 nanometrenin üzerinde emisyon ile ölçün. Son olarak, FRET sinyalini ikinci kanalda, 488 nanometre uyarım ve 585 nanometrenin üzerinde emisyon ile transfer kanalında ölçün.
İkinci kanaldaki sinyal dört farklı bileşenin toplamıdır: söndürülmüş donör sinyalinden çapraz konuşma faktörü S1 ile 585'in üzerindeki algılama kanalına spektral yayılma, çapraz konuşma faktörü S2 ile 488 nanometre ışık tarafından doğrudan uyarılmadan gelen alıcı sinyal, alıcının FRET tarafından uyarılmış donör molekülünden duyarlılaştırılmış emisyonu, ve arka plan sinyali. Donör kanalında, transfer kanalında ve alıcı kanalda, sadece GFP'yi eksprese eden hücrelerde, sadece kirazda, GFP ve kirazı birlikte eksprese eden hücrelerde ve GFP kiraz füzyon proteininde görüntüler elde edildi. GFP kiraz füzyon proteinini eksprese eden NRK hücrelerinde ve GFP kirazını birlikte eksprese edenlerde hesaplanan ortalama hücresel FRET verimlilikleri, her hücredeki alıcı-donör oranı yoğunluk oranı veya moleküler orana göre çizilmiştir.
GFP kiraz füzyon proteinini ifade eden, GFP ve kirazı negatif bir kontrol olarak birlikte ifade eden ve Ashwell-Morell reseptörünün reseptör alt birimlerini ifade eden hücrelerin normalleştirilmiş piksel piksel FRET görüntüleri burada gösterilmiştir. Sıçan hepatik lektininin RHL1 ve 2'si, plazma zarının sitoplazmik tarafında GFP ve kiraz ile etiketlendi. GFP RHL1 ve kiraz RHL2 ve GFP RHL1 delta stoğu ve kiraz RHL2'yi eksprese eden hücrelerin ortalama hücresel FRET verimlilikleri, alıcı-donör moleküler oranına göre çizilmiştir.
Sunulan nicel FRET yaklaşımı aşağıdakilere izin verir. Canlı hücrenin fizyolojik bağlamında protein etkileşimlerinin tespiti. Protein etkileşimlerinde zamanla meydana gelen değişiklikler.
Hücre altı bölmelerdeki etkileşimlerde, konfokal görüntünün piksel düzeyine göre piksele kadar olan etkileşimlerdeki farklılıklar. Ve tespit edilen FRET sinyalinin canlı bir hücrede ifade edilen moleküler alıcı-donör oranına bağımlılığı.
