يصف هذا البروتوكول عملية تجريبية خطوة بخطوة وخوارزمية رياضية لقياس FRET باستخدام تبريد المانحين والانبعاثات الحساسة المتقبلة. يتطلب القياس الكمي لكفاءات FRET في الخلية الحية تحديد الحديث المتبادل للبروتينات الفلورية والانبعاث النسبي وكفاءة الكشف عن الفلوروفورات في الإعداد المجهري. يمكن تقييم الحديث المتبادل عن طريق تصوير الخلايا التي تعبر عن فلوروفور واحد فقط.
يتطلب تقييم كفاءة الكشف عن جزيء مانح أو متقبل معرفة نسبة عدد جزيئات المتبرع والمستقبل التي تؤدي إلى إشارة القياس. يختلف عدد الفلوروفورات المعبر عنها في الخلايا الحية من خلية إلى أخرى وهو غير معروف. مسبار المعايرة المستخدم في هذه الطريقة ، وهو بروتين اندماج واحد لواحد بين المتبرعين والمستقبلين ، يجعل من الممكن تحديد كفاءة الكشف النسبية لجزيئات المتبرع والمستقبل.
للبدء ، استخدم متجه تعبير خلية الثدييات N1 مع mCherry 1 لتوليد مسبار الاندماج EGFP mCherry 1. صمم قليل النيوكليوتيدات لتضخيم EGFP بدون كودون توقف كخلية واحدة جزء BAM h1. يجب أن ينتج عن رابط الأحماض الأمينية الخمسة بين البروتين الفلوري الأخضر والأحمر نقص متوسط FRET لزوج مانح الكرز GFP من 0.25 إلى 0.3.
استخدم أي خط خلوي ووسائط بدون الفينول الأحمر لتقليل مضان الخلفية. بمجرد أن تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ ، افصلها بمليلتر واحد من 0.05٪ تريبسين EDTA وزرع حوالي 10،000 خلية في كل بئر من صفيحة ثمانية آبار عن طريق إضافة ثلاث قطرات من تعليق خلية خمسة ملليلترات. بعد 24 ساعة من الطلاء ، قم بنقل الخلايا باستخدام وسائط نقل مناسبة.
احتضان الخلايا لمدة 20 ساعة قبل تصوير الخلايا الحية للسماح بالتعبير المناسب عن البروتين الفلوري والطي والنضج. تخيل الخلايا في غرفة بيئية مرطبة ومدفأة عند 37 درجة مئوية باستخدام مجهر مسح متحد البؤر. لتخزين وسائط الخلية عند درجة الحموضة الفسيولوجية ، أضف 20 مللي مولار HEPES لجعل ثاني أكسيد الكربون في وسائط الخلية مستقلا.
ثم قم بتركيب الشريحة على المجهر. استخدم خط 488 نانومتر من ليزر أيون الأرجون لإثارة GFP وليزر الصمام الثنائي 561 نانومتر لإثارة الكرز. قم بإعداد ليزر 488 نانومتر للإثارة في القناة الأولى من خلال نطاق انبعاث من 505 إلى 530 نانومتر وفي القناة الثانية مع مرشح تمرير طويل يزيد عن 585 نانومتر.
استخدم ليزر 561 نانومتر للإثارة في القناة الثالثة مع مرشح تمرير طويل يزيد عن 585 نانومتر. قم بإثارة الليزرين بالتتابع واضبط وضع التصوير للتبديل بعد كل سطر بحيث يتناوب إثارة الصورة 512 × 512 بكسل بعد كل سطر. قم بإعداد سلسلة زمنية مصغرة من ثلاث صور لاكتشاف ما إذا كان هناك تبييض ضوئي كبير وتقليل طاقة الليزر إذا لزم الأمر.
أولا ، خلايا الصورة التي تعبر عن بنية اندماج الكرز GFP. قم بتعيين المعلمات التي تحدد كثافة الليزر المتكاملة زمنيا لكل بكسل في صورة متحدة البؤر. استخدم هدف زيت 63X وقم بضبط التكبير / التصغير على 3X لتصوير خلية بالكامل بتكبير ودقة كافيين.
استهدف حجم بكسل من 70 إلى 80 نانومتر. اضبط وقت بقاء البكسل على اثنين إلى أربعة ميكروثانية ونقل AOTF لليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر بحيث تظهر الصور نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة دون أي تبييض ولا توجد وحدات بكسل تشير إلى تشبع شدة التألق. اضبط طاقة الليزر 488 و 561 بحيث تكون مستويات الإشارة في القناة الأولى والقناة الثالثة متشابهة.
اضبط كسب مضاعف الصورة على 600 إلى 800. صورة من 15 إلى 20 خلية تعبر عن بروتين اندماج الكرز GFP ، والخلايا التي تعبر عن GFP ، والكرز ، و GFP والكرز ، والخلايا غير المعبرة. ثم خلايا الصورة تشارك في التعبير عن البروتينات ذات الأهمية إلى جانب GFP والكرز على التوالي.
لحساب FRET ، قم بقياس إشارة المتبرع في القناة الأولى ، القناة المانحة بإثارة 488 نانومتر ونطاق انبعاث من 505 إلى 530 نانومتر. ثم قم بقياس إشارة المستقبل في القناة الثالثة ، قناة المستقبل ذات الإثارة والانبعاث 561 نانومتر فوق 585 نانومتر. أخيرا ، قم بقياس إشارة FRET في القناة الثانية ، قناة النقل ذات الإثارة والانبعاث 488 نانومتر عند أعلى من 585 نانومتر.
الإشارة في القناة الثانية هي مجموع أربعة مكونات مختلفة: الامتداد الطيفي من إشارة المتبرع المروي إلى قناة الكشف التي تزيد عن 585 مع عامل الحديث المتبادل S1 ، إشارة المستقبل من الإثارة المباشرة بواسطة ضوء 488 نانومتر مع عامل الحديث المتبادل S2 ، الانبعاث الحساس للمتقبل بواسطة FRET من جزيء المتبرع المتحمس ، وإشارة الخلفية. تم الحصول على الصور في القناة المانحة ، وقناة النقل ، والقناة المستقبلة ، والخلايا التي تعبر عن GFP فقط ، والكرز فقط ، والتعبير المشترك عن GFP والكرز ، وبروتين اندماج الكرز GFP. يتم رسم متوسط كفاءات FRET الخلوية المحسوبة في خلايا NRK التي تعبر عن بروتين اندماج الكرز GFP وتلك التي تعبر عن كرز GFP مقابل نسبة كثافة نسبة المتقبل إلى المتبرع أو النسبة الجزيئية في كل خلية.
يتم عرض صور الحنق بالبكسل الطبيعية للخلايا التي تعبر عن بروتين اندماج الكرز GFP ، والتعبير المشترك عن GFP والكرز كعنصر تحكم سلبي ، والتعبير عن الوحدات الفرعية للمستقبلات لمستقبلات Ashwell-Morell هنا. تم تمييز RHL1 و 2 من الليكتين الكبدي للفئران ب GFP والكرز على الجانب السيتوبلازمي من غشاء البلازما. يتم رسم متوسط كفاءات الحنق الخلوي للخلايا التي تعبر عن GFP RHL1 والكرز RHL2 و GFP RHL1 دلتا الأسهم والكرز RHL2 مقابل النسبة الجزيئية المتقبلة إلى المانحة.
يسمح نهج FRET الكمي المقدم بما يلي. الكشف عن تفاعلات البروتين في السياق الفسيولوجي للخلية الحية. التغيرات في تفاعلات البروتين مع مرور الوقت.
الاختلافات في التفاعلات في المقصورات تحت الخلوية وصولا إلى مستوى البكسل حسب مستوى البكسل للصورة متحدة البؤر. واعتماد إشارة FRET المكتشفة على نسبة المستقبل الجزيئي إلى المتبرع المعبر عنها في خلية حية.
