Bu protokol, böbrek pelvisinin sağlam kalp pili bölgelerini, böbrek içindeki idrarı üretere ve mesaneye pompalayan düz kas organını verir. Hücreleri renal pelvisten izole etmenin aksine, bu yaklaşım renal pelvis kalp pili bölgelerinin yerinde ortamlarını sağlam bir şekilde sağlar ve renal pelvis pacemaking'i incelemek için daha fizyolojik bir hazırlık sağlar. Bu tekniği hiç yapmamış bir birey tek tip bölümleri kesmekte zorlanabilir.
İlk kez bir kullanıcı, böbreğin vibratom aşamasında seviyeli olduğundan ve kesme işlemini hızlandırmadığından emin olmalıdır. İç doku peripsleri ve iç diseksiyon makası kullanarak bağırsakları çimdikleyin ve karın duvarından uzaklaştırın. Aynı anda bağırsakların alt kısmını proksimal duodenum ve distal kolonda vücuttan serbest bırakarak böbrekleri içeren retroperitoneal alana erişin.
Üretterin distal ucunun doku tokmalarıyla hafifçe çimdiklenin ve kaldırın. Diseksiyon makasını kullanarak, sıkışan üretterin altından çevredeki bağ dokusundan kurtarılana kadar böbreğe doğru kesin. Böbrekler açığa çıktıktan sonra, bunları ayrı ayrı çıkarın.
Silikon elastomer kaplı bir kabı buz gibi KRB çözeltisi ile doldurun. Böbreği diseksiyon kabına aktarın ve tamamen su altında kalmasını sağlayın. Distal renal pelvisi veya RP ve proksimal üreteri ortaya çıkarmak için böbrek tabanından yağ dokusunu çıkarmak için ince yay makası ve iç toparlama kullanın.
İnce yay makası ve tokmaklar kullanarak proksimal üreter ve distal RP'nin bir kısmını tabandan çıkarın. Dış böbrek kapsülü ince uçlu asalarla delin, uçları böbrek vücudundan uzaklaştırın. Her elle toskum kullanarak, kapsülün gevşek uçlarını kıstırın ve kalan renal kapsül zarı tamamen çıkarılana kadar soyun.
Vibratom aletinin bıçak tutucusuna bir jilet yerleştirin ve bıçak temizleme açısını yaklaşık 18 dereceye ayarlayın. Bıçak parametrelerini metin el yazmasında belirtildiği gibi ayarlayın, böbrek bölümü kalınlığının 150 mikrometreyi geçmemesini sağlayın, bu da kalsiyum iyon görüntüleme deneylerini olumsuz yönde etkileyecektir. Hazırlanan böbreği buz gibi soğuk KRB çözeltisinden hafifçe kavramak ve çıkarmak için künt uçlu forseps kullanın.
Fazla dış nemi gidermek için böbreği hemen emici kağıda yaklaşık iki ila dört saniye yerleştirin. Parankiminin tüm taraflarının kurumasını sağlamak için böbreği emici kağıt boyunca hafifçe yuvarlayın, böylece böbreğin vibratom aşamasına en uygun şekilde yapıştırılması sağlanır. Vibratom numune plakasının tabanına hemen ince bir siyanoakrilat tutkal tabakası uygulayın ve böbrek üreter tarafını tutkalla kaplı alana yerleştirmek için künt uçlu tokalar kullanın.
Tutkalın kurutulan yaklaşık 10 ila 20 saniye boyunca forsepslerin düz kenarı ile böbreğin tepesine aşağı doğru basınç uygulayın. Numune plakasını tampon tepsisinin altına sıkıca sabitleyin ve KRB çözeltisinin seviyesini böbreğin üst kısmı tamamen daldıracak şekilde ayarlayın. Otomatik vibratom kesiti için, tüm böbrek düzleminin kesitli olduğundan emin olmak için vibratom bıçağı kesme döngüsünün 0,5 ila 1 santimetre böbreklerden temiz başlangıç ve bitiş pozisyonlarını seçin.
Bıçağın böbrekle temas ettiğinden emin olarak otomatik kesme işlemini başlatın. Toparlap kullanarak, böbrekten kurtarılan bölümleri toplayın ve hemen bireysel kuyulara aktarın. Kesit protokolüne devam edin ve PKJ bölgeleri belirginleşene kadar böbrek dilimlerindeki PKJ bölgelerini tanımlamak için hafif bir mikroskop kullanın.
Silikon elastomer kaplı bir görüntüleme kabını buz gibi KRB çözeltisi ile doldurun. Tek bir böbrek dilimini yemeğe aktarın. Bölümü görüntüleme kabının tabanına sabitlemek için bir böbrek diliminin çevresine Minutien pimleri yerleştirin.
Görüntüleme kabını dik dönen disk konfokal mikroskop sahnesine yerleştirin ve hemen KRB çözeltisi ile perfüzyona başlayın. Böbrek dilimini bulmak için düşük büyütme suyu daldırma objektif lens kullanın. Görüntüleme alanını, yer işaretlerini kullanarak PKJ'nin bulunduğu dilimdeki alanlara ortaleyin.
PKJ yer aldıktan sonra, ilgi alanını büyütmek için daha yüksek bir büyütme suyu daldırma objektif lensi kullanın. PKJ duvarındaki farklı kalsiyum iyon geçici sürelerinde farklı ilgi hücrelerini ayırt edin. İlgi çekici hücreler belirlendikten sonra, lazer yoğunluğunu iyi bir sinyal-gürültü oranı verecek şekilde ayarlayın ve görüntüleri 16 ila 32 Hertz arasında bir zamansal örnekleme frekansı ile kaydedin.
Tüm böbrek bölümlerinin hafif mikroskobik görüntüleri, tek bir PKJ bölgesinin açıklamalı simge yapılarını göstermektedir. İç medulla ve distal böbreğe yakın birden fazla PKJ bölgesi bulunur. PKJ renal arteriyellerinin ve PKJ sınırlarının yerleri burada gösterilmiştir.
PDGFR alfa pozitif hücrelerinde GCaMP'yi ifade eden bir fareden bir PKJ bölümü burada gösterilmiştir. Parankimal doku arasında asılı ince PKJ duvar, renal arteriole gibi yer işaretleri kullanılarak ayırt edilebilir. Bu spesifik transgenik dokuda GCaMP6f'ın ifadesi, PKJ'nin tüm genişliğine hem kas hem de macera katmanları boyunca yayılır.
PDGFR alfa GCaMP6f pozitif böbrek dilimlerinde, tipik olarak PKJ duvarının genişliğine uzanan bir hücre ağı floresandır ve çeşitli süre ve frekanslarda salınımlı kalsiyum iyon geçicilerini görüntüler. SMC GCaMP3 pozitif böbrek dilimlerinde, kas tabakasında bir GCaMP3 pozitif hücre tabakası bulunur. Bir mekansal harita, PKJ adventitia'da bulunan PDGFR alfa pozitif hücrelerinin uzun süreli düşük frekanslı kalsiyum iyon geçicilerini ortaya çıkarırken, SMC'lerin daha kısa süreli kalsiyum iyon geçicilerini daha sık ateşlediğini göstermektedir.
Benzer şekilde, toplama kanalları ve çevresindeki bir dizi floresan kalsiyum iyon sinyali ve SMC'lerde salınımlı kalsiyum iyon geçicileri de gözlenmiştir. Bu işlemi denerken, tek tip böbrek dilimlerinin bloktan kurtarılmasını sağlamak için vibratom kesiti sırasında böbreğin mümkün olduğunca seviyeli olması önemlidir. Bu işlemi takiben, renal pelvisteki kalp pili mekanizmalarına ilişkin anlayışımızı artırmak için tek hücreli izolasyon, immünhistokimya ve moleküler çalışmalar gibi diğer yöntemler yapılabilir.
