Bu çalışma kısmen Kansas INBRE, Li ve Zinovyeva'ya P20GM103418 ve Zinovyeva'ya R35GM124828 tarafından desteklendi. Min Han'a anti-AIN-1 antikorlarını cömertçe paylaştığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma boyunca kullanılan suşların bir kısmı NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) tarafından sağlanmıştır.

1. Solucan numunesi toplama
<ol><li>Ngm katı plakalarında gerekli sıcaklıkta tohum karışık aşaması veya senkronizeedilmiş 13 solucan ve solucanların istenen aşamaya kadar büyümesini sağlar. Temel C. elegans büyüme ve bakım için, stiernagle ve ark. ve Porta-de-la-Riva ve ark.14,13bakınız.</li>
	<li>Solucan plakalarını M9 tamponu ile yıkayarak solucanları 15 mL konik santrifüj tüpünde toplayın.</li>
	<li>Solucanları oda sıcaklığında (RT) 2 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleme yaparak peletlayın ve süpernatantı atın. NOT: Ekstrakt hazırlama için solucan pelet boyutu 100 μL ile 500 μL arasındadır. Aşağı akış immün önkupitasyon deneyleri için 300 μL'lik bir solucan peleti önerilir ve tipik olarak toplam proteinin ~4,5 mg'ını, 500 μL'lik bir pelet ise ~7,5 mg toplam protein verir.</li>
	<li>M9 tamponu ile ek 3-5 yıkama gerçekleştirin (bkz. Tablo 1) veya süpernatant artık bulutlu olana kadar.</li>
	<li>DDH2O ile son bir yıkama gerçekleştirin.</li>
	<li>Gevşek solucan peletini 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne taşıyın ve 2 dakika boyunca RT'de 400 x g'da aşağı doğru döndürün. Paketlenmiş bir solucan peleli elde etmek için kalan süpernatant atın ve hazırlığı çıkarmaya devam edin. NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Solucan topakları hemen sıvı nitrojende dondurulabilir ve -80 °C'de veya sıvı nitrojende saklanabilir. Solucan peletlerinin sadece bir kez çözülebileceğini ve yeniden çözüleemeyeceğini lütfen unutmayın.</li>
</ol>2. Solucan peletinin hazırlanması
NOT: Ekstrakt hazırlığı buz üzerinde veya 4 °C'de yapılmalıdır.
<ol><li>Donmuşsa, solucan peletlerini buzda çözün. NOT: Numune toplama sırasında istenen 300 μL'lik paketlenmiş solucan pelet boyutu elde edilemezse, daha fazla ekstraksiyon için yeterli malzeme bulunana kadar birden fazla küçük pelet birleştirilebilir.</li>
	<li>Eşit hacimde buz gibi 2x lizis tamponu ekleyin (60 mM HEPES, pH = 7.4, 100 mM potasyum klorür, %0.1 Triton X, 4 mM magnezyum klorür, %10 gliserol, RNase inhibitörü, proteaz inhibitörü ve fosfataz inhibitörleri ile 2 mM DTT; bkz. Tüpün altındaki karışımı toplamak için tüpleri aşağı çevirin.</li>
	<li>Karışımı metal boncuk içeren 1,5 mL RNase içermeyen bir tüpe taşıyın (bkz. Malzeme Tablosu)ve numuneyi boncuk değirmeni homojenizatörüne koyun (bkz. Malzeme Tablosu)4 °C'de. Tüp kapaklarının sıkılsın ve numuneler homojenizatör içinde dengelendirilsin.</li>
	<li>Numuneyi 4 dakika boyunca en yüksek hızda (ayar 12) homojenize edin.</li>
	<li>Numuneyi boncuklardan çıkarın ve yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Alternatif olarak, boncukları numuneden çıkarmak için homojenizatör ile birlikte verilen bir mıknatıs kullanılabilir.</li>
	<li>Protein ekstresini netleştirmek için özü 4 °C'de 20 dakika boyunca 19.000 x g'da döndürün.</li>
	<li>Üst kısmı buz üzerinde taze bir 1,5 mL tüpe aktarın, bu arada numunenin üstünde oluşan beyaz, bulutlu çökeltmenin taşınmasından kaçının. Süpernatant artık netleştirilmiş özüdür. NOT: Toplam protein konsantrasyonu belirlemek için netleştirilmiş ekstrakt 10 μL tasarruf edin.</li>
	<li>Aşağıdaki deneyler için özü hemen kullanın veya özü sıvı nitrojende flaşla dondurun ve -80 °C'de saklayın. NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Ekstraktlar ultra düşük sıcaklıkta saklanabilir (-80 °C dondurucu veya sıvı azot ~6 ay). Dondurulmuş özler bir kez çözülebilir ve yeniden dondurulamaz.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre deterjanlarla uyumlu bir protein konsantrasyonu test kiti kullanarak özün toplam protein konsantrasyonunun belirlenmesi (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
</ol>3. İmmün önseçme
NOT: Ekstrakt hazırlama için tüm immün önseçim adımları buz üzerinde veya 4 °C'de yapılmalıdır. Her immün önksepitasyon için 2 mg toplam protein kullanılması önerilir. Bununla birlikte, 0.8-1 mg toplam protein ile başarılı immün prempripitasyonlar gerçeklenmiştir. Her zaman taze veya taze çözülmüş protein özleri kullanın. Aşağıdaki protokol, 2 mg toplam proteinden veya tek bir immün önksepitasyon deneyinden immün önksepitasyon yapmak için özetlenmiştir. Boncuk ve antikor miktarı birden fazla örnek için veya farklı miktarda protein özü kullanılırsa arttırılabilir veya azaltılabilir.
<ol><li>Protein özünü buza yerleştirin veya çözün. Numune buz gibi 1x lizis tamponu ile 10 mg/mL veya 5 mg/mL'ye seyreltilebilir (bkz. Tablo 1).</li>
	<li>Manyetik boncukları ters çevirme ile yeniden diriltin ve %50 boncuk süspansiyonunun 150 μL'sini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Boncukları 1 dakika boyunca veya çözelti netleşene kadar manyetik bir standa karşı buz üzerinde mıknatıslandırın. Üstnatant atın.</li>
	<li>Tüpü manyetik standdan çıkarın ve boncuk bulamacının 2 hacmini (yani 300 μL) kullanarak boncukları 1x lizis tamponunda yıkayın. Toplam üç yıkama için yıkamayı 2x tekrarlayın.</li>
	<li>Boncukları 150 μL buz gibi lizis tamponunda yeniden depola.</li>
	<li>Boncuk bulamacının 75 μL'sini 2 mg protein özüne aktarın ve nazik ajitasyonla 1 saat boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın. Kalan boncuk süspansiyonu daha sonra kullanmak üzere buz üzerinde sakla. NOT: Bu adım, immün önseçme adımı sırasında boncuklara spesifik olmayan protein bağlanmasını azaltmak için gerçekleştirilir.</li>
	<li>Numuneli tüpü 1 dakika boyunca veya boncuklar tamamen mıknatıslanana ve numune temizlenene kadar buz üzerindeki manyetik standa yerleştirin. Süpernatant yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın; boncukları rahatsız etmeyin. Bu önceden tanımlanmış protein lysate. Batı leke analizi için numunenin %10'unu sakla.</li>
	<li>Önceden tanımlanmış lysate 20 μg benzeşim saflaştırılmış antikor ekleyin ve nazik ajitasyon ile 1 saat boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın. NOT: İmmün prempripitasyon için kullanılan antikor miktarı antikor ve proteine özgüdür ve hedef proteinin etkili immün önksezisini sağlamak için ampirik olarak belirlenmelidir.</li>
	<li>Önceden yıkanmış boncuk süspansiyonunun kalan 75 μL'lik kısmını (adım 3,5) antikor/lisat karışımına ekleyin ve hafif ajitasyonla 4 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tüpü manyetik standa 1 dakika boyunca veya boncuklar tamamen mıknatıslanana ve numune temizlenene kadar buz üzerinde yerleştirin. Batı blot analizi için süpernatantı kaydedin (isteğe bağlı).</li>
	<li>İmmünprecipitate 3x içeren boncukları 450 μL yıkama tamponunda (30 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM potasyum klorür, %0,1 Triton X, 2 mM magnezyum klorür, %10 gliserol, 1 mM DTT; bkz. Tablo 1)buz üzerinde yıkayın. NOT: Daha sıkı yıkama koşulları tercih edilirse ek yıkamalar yapılabilir.</li>
	<li>Boncuk peletini 20 μL 2x SDS/BME protein jeli yükleme tamponuna (bkz. Malzeme Tablosu)ve denatüreyi bir SDS-PAGE jeline yüklenmeden önce 95 °C'de 5 dakika kaynatarak yeniden kullanın. Alternatif olarak, denatüre numuneler birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir. NOT: İstenirse, boncuk immünödeksilatın bir kısmı aşağı akış RNA izolasyonu için kaydedilebilir.</li>
</ol>4. IP örneklerinin Batı lekesi tespiti
<ol><li>IP örneklerini SDS-PAGE jeline yükleyin (bkz. Malzeme Tablosu). IP tüplerini numunenin aspirasyonundan önce 1 dakika boyunca manyetik standa yerleştirerek boncukları aktarmaktan kaçının.</li>
	<li>Batı şişkinliğini15,16 ve antikor boyama16'yı aşağıdaki değişikliklerle gerçekleştirin: ALG-1 antikorunu% 5 yağsız kuru sütte (NFDM)17 1:500 seyreltin; HRPK-1 antikor 2 1:1.000%5 NFDM'de seyreltin; ve AIN-1 antikor 18 1:10.000%NFDM'de seyreltin. İkincil antikorlar (bkz. Malzeme Tablosu)üreticinin talimatlarına göre kullanılmıştır.</li>
	<li>Hrp bazlı kemimuminesans ile bantları tespit edin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations.">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li><li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRPK-1,+a+conserved+KH-domain+protein,+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development.">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal.">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li><li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li><li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers.">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li><li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans.">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li><li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer:+an+old+tool+for+a+new+application.">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li><li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans:+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes.">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).</li><li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes.">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li><li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing.">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li><li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans.">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li><li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2&#8217;-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices.">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2&#8217;-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression.">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins,+miRNAs,+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2.">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms.">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).</li><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

C. elegans hücre, moleküler ve gelişim biyolojislerindeki temel soruları incelemek için mükemmel bir modeldir19. Genetik bir model sistemi olarak gücüne ek olarak, C. elegans protein immüno-immün önseçim ve eş-immünoselipitasyon dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere biyokimyasal yaklaşımlara açıktır. İmmün prempripitasyon deneyleri yaparken olası bir engel, ilgi proteinlerine özgü antikorların eksikliğidir. Antikor yoksa özel poliklonal veya monoklonal antikorlar üretilebilir. Bununla birlikte, genom düzenleme teknolojisindeki son yenilikler, araştırmacıların mutasyonları hızla tanıtmasına veya endojen C. elegans genlerini etiketlemesine izinvermiştir 20,21, genler ve kodlanmış proteinler arasındaki genetik, fonksiyonel ve fiziksel etkileşimleri çözen çalışmaları kolaylaştırmaktadır. Özellikle, CRISPR/Cas9 aracılı sonojen loci'deki C. elegans genlerinin etiketlenmesi, immün önseçim deneylerinin antikor kullanılabilirliği üzerindeki bağımlılığını azaltarak, eş-immün özürlülüğü deneylerini çok daha uygulanabilir hale getirdi. C. elegans genleri, GFP veya mCherry gibi floresan etiketlerden FLAG ve HA gibi küçük etiketlere kadar çeşitli etiketlerle etiketlenebilir. Bu etiketleri tanıyan antikorlar ticari olarak kolayca kullanılabilir ve immün önkupseleme yaklaşımları yoluyla protein-protein etkileşimlerinin çalışmalarını kolaylaştırır.
Şekil 1'deözetlenen sunulan protokol, az sayıda numune için gerçekleştirilebilir veya ölçeklendirilebilir ve aynı anda 24 numune hazırlığına izin verir. İmmün önseçme yoluyla protein-protein etkileşimlerinin ilk nitelemeleri tipik olarak normal büyüme koşulları altında vahşi tip arka planlarda yapılırken, takip çalışmaları genellikle protein-protein etkileşimlerinin çeşitli genetik arka planlarda veya farklı büyüme koşullarında test edilmesini gerektirir. Aynı anda birden fazla ekstrakt hazırlama yeteneği zaman kazandırır ve daha da önemlisi, farklı numuneler arasında ekstrakt hazırlama tutarlılığı sağlar. Negatif bir kontrol her zaman gereklidir, ideal kontrol, immün önkoşüle edilmiş ilgi proteini için gen kodlamasında boş bir mutasyondur (bkz. Şekil 3 ve Şekil 4 örnek olarak).
Bu ekstrakt protokolü, C. elegans örneklerinden hızlı protein özü hazırlanmasına izin verir ve zirkonyum boncuk bazlı homojenizasyon8ile karşılaştırılabilir. Genel olarak boncuk homojenizasyonu, çeşitli boncuk değirmeni homojenizatörleri veya benzeri ekipmanlar kullanılarak birden fazla eşzamanlı numune preparatlarına kadar ölçeklendirilebilir. Bununla birlikte, bazı daha ekonomik boncuk değirmeni homojenizatörleri aynı anda işlenebilen numune sayısını azaltabilir. Alternatif olarak, sunulan ekstrakt protokolü, ekonomik bir alternatifi temsil eden dounce bazlı ekstrakt hazırlığı ile uyumludur. Farklı boncuk değirmeni homojenizatörleri test edilmede de, C. elegans örneklerinin tamamen bozulması sağlandığınız sürece, çoğu bu protein özü protokolü ile uyumlu olabilir.
Sunulduğu gibi, bu ekstrakt hazırlama protokolü, protein immünoselipitasyon2 ve microRNA aşağı çekme12 dahil olmak üzere birden fazla aşağı akış deneyi ile uyumludur ve hem protein hem de RNA bileşenlerinin aşağı akış toplanmasına izin verir. Ayrıca hem nükleer hem de sitoplazmik proteinleri verimli bir şekilde çıkarır (Şekil 2, Şekil 3ve Şekil 4). Benzer şekilde, sunulan immünoprecipitasyon protokolü protein ilişkili immünödepitaitlerden RNA izolasyonuna izin eder. İmmün önkekseleme protokolü başlangıçta ALG-1 protein etkileşimcilerini tanımlamak için geliştirilmiş olsa da, yöntem ilgi çekici proteinler arasındaki etkileşimleri test etmek için uyarlanabilir. Aslında, kullanılan immün prempripipitasyon koşulları ALG-1 (Şekil 3) ve HRPK-1 (Şekil 4)immünoprecipitasyon için eşit derecede iyi çalıştı. Bu protokol, RNA bağlayıcı proteinlerin immünpurifikasyonu için mükemmel bir başlangıç noktasıdır. Bununla birlikte, diğer ilgi proteinleri için tampon bileşiminde bazı değişikliklerin gerekli olabileceği belirtilmelidir. Değişiklikler, ilgi çekici proteinin fiziksel ve biyokimyasal özelliklerine bağlı olabilir ve duruma göre uygulanmalıdır.
Hedef protein (burada, ALG-1 veya HRPK-1) immün premünipit hale geldikten sonra, Batı şişkinliği belirli protein etkileşimcileri için ko-immünoprecipitate'i test etmek için kullanılabilir.
Alternatif olarak, kopurified immünprecipitate tüm putatif etkileşim proteinlerini tanımlamak için kütle spektrometresi analizine tabi tutulabilir. Doğrulanmış eş-immün özürlü etkileşimler daha sonra belirli etkileşimin potansiyel düzenlemesini belirlemek için çeşitli genetik geçmişlerde veya koşullarda incelenebilir. Örneğin, HRPK-1'in ALG-1/AIN-1 miRISC derlemesinde rol oynayıp oynamadığını belirlemek için, ALG-1-AIN-1 coprecipitation hem vahşi tip arka planda hem de HRPK-1 yokluğunda değerlendirildi (Şekil 3). hrpk-1'in ALG-1/AIN-1etkileşimi 2 (Şekil 3)için dağıtılabilir olduğu bulunmuştur. Ek olarak, CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknolojisi, ilgi çekici proteinlerde tek nokta veya alan adı silme mutasyonları oluşturmak için kullanılabilir. Üretilen mutantların protein etkileşimcileriyle işbirliği yapma yeteneğini yeniden test etmek, hangi etki alanlarının veya kalıntıların fiziksel etkileşime aracılık ettiğini ortaya açabilir. Bu tür gelecekteki çalışmalar, protein fonksiyonu ve regülasyon mekanizması hakkında paha biçilmez bilgiler verebilir. Bu yaklaşımlar, C. elegans genetiğinin gücü ile birlikte, hayvan gelişimini ve hücresel işlevi yöneten temel moleküler süreçler hakkında önemli içgörüler sağlayabilir.

İlgi çekici bir proteinin makromoleküler etkileşimlerini tanımlamak, işlevi hakkında daha fazla bilgi edinmenin anahtarı olabilir. İmmün prempripitasyon ve eş-immünovipitasyon deneyleri, büyük ölçekli proteomik yaklaşımlar1 yoluyla bir proteinin tüm etkileşimini tanımlamak veya bir proteinin hipotezlenmiş bir interactor ile işbirliği yapma yeteneğini özellikle test etmek için kullanılabilir. C. elegans'da, gen ekspresyonunu düzenlemek için mikroRNA'larla yakından çalışan proteinler de dahil olmak üzere çeşitli proteinlerin aktivitesi hakkında daha fazla bilgi edinmek için her iki yöntem de başarıyla 2,3,4. Ortak immün premünipitasyon deneyleri, protein-protein etkileşimlerini kendi doğal hücresel ortamlarında test etme avantajına sahiptir, ancak ekstrakt hazırlama zor ve zaman alıcı olabilir. Numunenin verimli lizisi gereklidir, ancak protein-protein etkileşimlerinin bozulmasını en aza indirmek için dikkatli olunmalıdır. C. elegans toplam protein özlerini başarıyla hazırlamak için5,sonication6, Balch homojenizasyon7ve zirkonya boncukları-homojenizasyon8,9 gibi yöntemler kullanılmıştır. Bu yöntemler, zirkonya boncuk homojenizasyonu dışında, aynı anda işlenebilen numune sayısı açısından sınırlamalara sahiptir. Sunulan, C. elegans örneklerinden yüksek verimli, hızlı protein özü hazırlanmasına izin vermek için kolayca ölçeklendirilebilen alternatif biryöntemdir. Özellikle, yöntem aynı anda 24 numune hazırlayabilir ve ekstrakt hazırlığı için gereken süreyi büyük ölçüde azaltabilir. Bunun aksine, örneğin, douncing genellikle aynı anda yalnızca bir örnek hazırlamaya izin verir. Bu ekstrakt yöntemi, C. elegans'ınherhangi bir gelişim aşamasından özler hazırlamak için kullanılabilir.
Açıklanan, başarılı protein çekme ve ortak immün önseçimli proteinin tespitini doğrulamak için hayvan örneği toplama, ekstrakt hazırlama, immün önseçimleme ve Batı şişkinlik verilerinin sunumu için adım adım bir prosedürdür. Protokolün etkinliğini göstermek için, 1) microRNA Argonaute ALG-1 ve GW182 homolog olan AIN-1 arasında iki ortak immün önseçim deneyi yapıldı; ve 2) ALG-1 ve HRPK-1, yeni tanımlanmış bir ALG-1 interactor2. ALG-1 ve AIN-1, mikroRNA kaynaklı susturma kompleksini (miRISC) oluşturan temel proteinlerdir ve bu iki protein arasındaki etkileşim iyi belirlenmiştir10,11. Ekstrakt hazırlama protokolü ALG-1-AIN-1 eş-immünoselipitasyon deneyinde etkili oldu. Bu protokol ayrıca ALG-1 ve yeni tanımlanan etkileşimcisi HRPK-12arasındaki etkileşimi başarıyla doğruladı.
Özetle, makale, proteinler arasındaki yeni veya hipotez etkileşimleri tanımlamak veya doğrulamak için kullanılabilecek bir eş-immün özürlülük protokolü ile birlikte 24 örneği aynı anda işlemek için ölçeklendirilebilen bir C. elegans özü hazırlama protokolünü tanımlamaktadır. Ekstrakt hazırlama protokolü, protein immün önkeksasyonu2 ve mikroRNA çekmeleri12dahil olmak üzere bir dizi aşağı akış deneyi ile uyumludur. Ayrıca, immün önksezi protokolü, çeşitli genetik geçmişlerde iki veya daha fazla endojen, endojen olarak etiketlenmiş veya aşırı ifade edilmiş C. elegans proteinleri arasındaki etkileşimleri test etmek için uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>15 mL tube</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>STEP 1.2</td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>BioRed</td><td>1610737</td><td>STEP 3.11</td></tr><tr><td>4&amp;ndash;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>BioRed</td><td>4561096</td><td>STEP 4.1</td></tr><tr><td>anti-AIN-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007</td></tr><tr><td>anti-ALG-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated by PRF&amp;amp;L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>anti-HRPK-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated by PRF&amp;amp;L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm Homogenizer</td><td>MidSci</td><td>BBY24M</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779-5G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td><td>Thermo Fisher</td><td>10002D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>EDTA-free protease inhibitors</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>GFP antibody (FL)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8334</td><td>Figure 2</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher</td><td>G33-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP</td><td>BioRed</td><td>1662408</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>31470</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit</td><td>LI-COR</td><td>926-95000</td><td>STEP 4.3</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate ACS</td><td>VWR</td><td>VWRV0288-500G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Anhydrous</td><td>Thermo Fisher</td><td>M65-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td>STEP 1.6</td></tr><tr><td>N2 wild type</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL)</td><td>MidSci</td><td>NAVYR1-RNA</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor cocktail 2</td><td>Sigma</td><td>P5726-1ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor cocktail 3</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Thermo Fisher</td><td>P217-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Thermo Fisher</td><td>P285-3</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>RC DC Protein Assay Kit I</td><td>BioRed</td><td>5000121</td><td>STEP 2.9</td></tr><tr><td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td><td>Thermo Fisher</td><td>S374-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>TritionX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>UY38 hrpk-1(zen17)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT3841 alg-1(tm492)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protein extract preparation and co-immunoprecipitation from caenorhabditis elegans

Protein-protein etkileşimlerini incelemek için sıklıkla ko-immünoselipitasyon yöntemleri kullanılmaktadır. Hipotezlenmiş protein-protein etkileşimlerinin onaylanması veya yenilerinin tanımlanması, ilgi çekici bir proteinin işlevi hakkında paha biçilmez bilgiler sağlayabilir. Ekstrakt hazırlama için geleneksel yöntemlerden bazıları sıklıkla emek yoğun ve zaman alıcı teknikler gerektirir. Burada, boncuk değirmeni homojenizatörü ve metal boncuklar kullanılarak değiştirilmiş bir ekstrakt hazırlama protokolü, geleneksel protein hazırlama yöntemlerine hızlı bir alternatif olarak tanımlanmaktadır. Bu ekstrakt hazırlama yöntemi aşağı akış eş-immüno-immün önksepitasyon çalışmaları ile uyumludur. Örnek olarak, yöntem C. elegans mikroRNA Argonaute ALG-1 ve bilinen iki ALG-1 interactor'u başarıyla eş-immünprecipitate etmek için kullanıldı: AIN-1 ve HRPK-1. Bu protokol, hayvan örneği toplama, ekstrakt hazırlama, ekstrakt açıklama ve protein immün önseçiminin açıklamalarını içerir. Açıklanan protokol, çeşitli genetik geçmişlerde iki veya daha fazla endojen, endojen olarak etiketlenmiş veya aşırı ifade edilmiş C. elegans proteinleri arasındaki etkileşimleri test etmek için uyarlanabilir.

Bu protokol (Şekil 1'deşematize edilmiş) birkaç proteinin aşağı akış immün önkupitasyonu için C. elegans toplam protein özlerini (Şekil 2) elde etmek için başarıyla kullanılmıştır2 (Şekil 3 ve Şekil 4). Sunulan boncuk değirmeni homojenizatör protokolü, toplam protein ekstraksiyonunda dounce bazlı yöntemlerle (Şekil 2) ve verimli bir şekilde çıkarılan nükleer (COL-19::GFP(NLS) (Şekil 2) ve sitoplazmik proteinlerle karşılaştırılabilirdi (Şekil 3 ve Şekil 4). Çeşitli boyutlarda birden fazla örnek aynı anda çıkarılmıştır(Şekil 2). Argonaute proteinleri GW182 protein ailesinin üyeleriyle etkileşime girerek hedef haberci RNA'lara bağlanan ve ifadelerini bastıran miRISC'leri oluşturur10. Şekil 3, öncekiraporlar11,17ile tutarlı olarak çekirdek miRISC bileşenleri ALG-1 ve AIN-1'in başarılı bir şekilde eş-immün önseçimini göstermektedir. Daha yakın zamanda, mikroRNA biyogenez ve aktivitenin yardımcı faktörler tarafından nasıl düzenlenebileceği hakkında daha fazla bilgi edinmek için ArgonauteALG-1 3'ün ek protein etkileşimcilerini belirlemeye yönelik çalışmalar yapılmıştır. RNA bağlayıcı protein HRPK-1, ALG-1 immünoprecipitates3'tetanımlanmıştır. Bu etkileşim yakın zamanda karşılıklı bir HRPK-1 immün önksepitasyon deneyi2'de doğrulandı. Sunulan ekstrakt ve immün premünipitasyon protokolleri HRPK-1'e özgü ko-immünoselipitaitlerde ALG-1'i başarıyla geri kazanmıştır (Şekil 4). Buna ek olarak, ALG-1-AIN-1 etkileşimi çeşitli genetik arka planlarda test edildi ve HRPK-1'in ALG-1/AIN-1 miRISCderlemesi 2 (Şekil 3)için gereksiz olduğu gösterildi. Ek rakamlar, tam membran problanmış olarak göstermek için sağlanmıştır(Ek Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> Şekil 1: C. elegans özü hazırlama ve immün önkupseleme için iş akışı şeması. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> Şekil 2: Nükleer lokalize GFP, COL-19::GFP (NLS), 250 μL ve 100 μL solucan peletlerinden dounce hazırlanmış ve homojenize numunelerdeki seviyelerin Batı blot karşılaştırması. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> Şekil 3: GW182 homolog AIN-1 ALG-1 ile birlikte immünoselipitatlar. ALG-1 immünöteritlerinde ALG-1 ve AIN-1 proteinleri için batı şişkinliği. ALG-1/AIN-1 ko-immünopipitasyonu hrpk-1'in yokluğundan etkilenmedi. Giriş = IP'nin %10'unu. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> Şekil 4: ALG-1 HRPK-1 ile eş-immünoprecipitates. HRPK-1'de HRPK-1 ve ALG-1 için Batı blottingi gösterilmiştir. Giriş = IP'nin %10'unu. * antikor ağır zincirini gösterir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">M9 arabelleği (1 L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>1 L'ye kadar</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x Lizis tamponu (5 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>%10 TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>%100 gliserol</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>5 mL'ye kadar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taze ekleyin:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA içermeyen proteaz inhibitörü</td>
			<td>1 tablet</td>
		</tr>
<tr>
<td>fosfataz inhibitörü kokteyl 2</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fosfataz inhibitörü kokteyl 3</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Lizis arabelleği</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x Lizis tamponu eşit hacimde ddH20 ile seyreltin.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Yıkama tamponu 10 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>300 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>%10 TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>%100 gliserol</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>10 mL'ye kadar</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL (taze ekleyin)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Tarifler
Ek Şekil 1. Şekil 2-4 oluşturmak için kullanılan tam problu Batı leke zarları gösterilmiştir. (A) Şekil 2 için problanmış membran. Membran, GFP ve Tubulin için eşzamanlı problama için kesildiğini ve genel leke boyutunu azalttığını unutmayın. (B) Şekil 3 için problanmış membran. (C) Şekil 3 için problanmış membran. *antikor ağır zincirini gösterir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Bu yöntem, Caenorhabditis elegans örneklerinden ve daha sonra eş-immünoselipitasyondan yüksek verimli protein özü hazırlanması için bir protokol açıklar.

Caenorhabditis elegans'tan Protein Özü Hazırlama ve Eş-immün premobpriktiasyon

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

8.8K Görüntüleme.  Kansas State University. Bu yöntem, Caenorhabditis elegans örneklerinden ve daha sonra eş-immünoselipitasyondan yüksek verimli protein özü hazırlanması için bir protokol açıklar.

Video: Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in several diseases including cancer. The free-living nematode C. elegans possesses an evolutionary and functionally conserved EGFR-RAS-ERK MAP signal cascade which is central for the development of the vulva. Gain of function mutations in RAS homolog LET-60 and EGFR homolog LET-23 induce the generation of visible nonfunctional ectopic pseudovulva along the ventral body wall of these worms. Previously, the multivulval (Muv) phenotype in these worms has been shown to be inhibited by small chemical molecules. Here we describe a protocol for using the worm in a liquid-based assay to identify inhibitors that abolish the activities of EGFR and RAS proteins. Using this assay, we show R-fendiline, an indirect inhibitor of K-RAS, suppresses the Muv phenotype expressed in the let-60(n1046) and let-23(sa62) mutant worms. The assay is simple, inexpensive, is not time consuming to setup, and can be used as an initial platform for the discovery of anticancer therapeutics.

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The genetically tractable nematode Caenorhabditis elegans can be used as a simple and inexpensive model for drug discovery. Described here is a protocol to identify anticancer therapeutics that inhibit the downstream signaling of RAS and EGFR proteins.

Caenorhabditis elegans kullanılarak EGFR ve RAS inhibitörlerinin tanımlanması

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

Kanser Araştırmaları

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

In Vivo Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi Caenorhabditis elegans Protein Etkileşimleri Çalışması için

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Biyokimya

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully utilized in the biochemical study of biological reactions using its nuclear extracts such as in vitro transcription and DNA replication. A significant hurdle for using C. elegans in biochemical studies is disrupting the nematode&#39;s thick outer cuticle without sacrificing the activity of the nuclear extract. While several methods are used to break the cuticle, such as Dounce homogenization or sonication, they often lead to protein instability. There are no established protocols for isolating active nuclear proteins from larva or adult C. elegans for in vitro reactions. Here, the protocol describes in detail the homogenization of larval stage 4 C. elegans using a Balch homogenizer. The Balch homogenizer uses pressure to slowly force the animals through a narrow gap breaking the cuticle in the process. The uniform design and precise machining of the Balch homogenizer allow for consistent grinding of animals between experiments. Fractionating the homogenate obtained from the Balch homogenizer yields functionally active nuclear extract that can be used in an in vitro method for assaying transcription activity of C. elegans.

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Here, we describe a detailed protocol for isolating active nuclear extract from larval stage 4 C. elegans and visualizing transcription activity in an in vitro system.

Aktif Caenorhabditis elegans'ın in vitro transkripsiyon için Nükleer Ekstrakt ve Rekonsitasyonu İzolasyonu

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Biyoloji

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Kombine nükleotit ve Caenorhabditis elegans Protein çekimi

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble proteins over 40% of the time results in an extension of the lifespan in C. elegans, suggesting that many of these proteins are key determinants of the aging process. Isolation and quantitative identification of these insoluble proteins are crucial to understand key biological processes that occur during aging. Here, we present a modified and improved protocol that details how to extract and isolate the SDS-insoluble proteins (insolublome) from C. elegans more efficiently to streamline mass spectrometric workflows via a novel label-free quantitative proteomics analysis. This improved protocol utilizes a highly efficient sonicator for worm lysis that greatly increases efficiency for protein extraction and allows us to use significantly less starting material (approximately 3,000 worms) than in previous protocols (typically using at least 40,000 worms). Subsequent quantitative proteomic analysis of the insolublome was performed using data-dependent acquisition (DDA) for protein discovery and identification and data-independent acquisition (DIA) for comprehensive and more accurate protein quantification. Bioinformatic analysis of quantified proteins provides potential candidates that can be easily followed up with other molecular methods in C. elegans. With this workflow, we routinely identify more than 1000 proteins and quantify more than 500 proteins. This new protocol enables efficient compound screening with C. elegans. Here, we validated and applied this improved protocol to wild-type C. elegans N2-Bristol strain and confirmed that aged day-10 N2 worms showed greater accumulation of the insolublome than day-2 young worms.

<meta charset="utf8"></head><body>Yaşlanma Sırasında Caenorhabditis elegans'ta Çözünmeyen Protein Agregasyonunun Yeni Bir Veriden Bağımsız Edinim İş Akışı ile Miktar Tayini

This novel workflow efficiently extracts and isolates SDS-insoluble proteins (insolublome) from Caenorhabditis elegans with minimal starting material for quantitative differential proteomic analysis. The protocol uses a comprehensive data-independent acquisition mass spectrometry analysis to quantify the insolublome and bioinformatic analysis to gain biological insights into aging mechanisms and pathologies.

Yaşlanma Sırasında Caenorhabditis elegans'ta Çözünmeyen Protein Agregasyonunun Yeni Bir Veriden Bağımsız Edinim İş Akışı ile Miktar Tayini

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble ...

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and sequencing. The traditional proteinase K-based methods for genomic DNA extraction from C. elegans take several hours. Commercial extraction kits that effectively break open the C. elegans cuticle and extract genomic DNA are limited. An easy, faster (~15 min), and cost-efficient method of extracting C. elegans genomic DNA that works well for classroom and research applications is reported here. This DNA extraction method is optimized to use single or a few late-larval (L4) or adult nematodes as starting material for obtaining a reliable template to perform PCR. The results indicate that the DNA quality is suitable for amplifying gene targets of different sizes by PCR, permitting genotyping of single or a few animals even at dilutions to one-fiftieth of the genomic DNA from a single adult per reaction. The reported protocols can be reliably used to quickly produce DNA template from a single or a small sample of C. elegans for PCR-based applications.

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Presented here is a description of the straightforward and relatively rapid isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA from one or a few animals using a commercially available tissue kit. The resulting gDNA preparation is a suitable template for PCR.

Caenorhabditis elegans Genomik DNA'sının Küçük Ölçekli Ekstraksiyonu

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

Caenorhabditis elegans'tan Protein Özü Hazırlama ve Eş-immün premobpriktiasyon

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Caenorhabditis elegans kullanılarak EGFR ve RAS inhibitörlerinin tanımlanması

In Vivo Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi Caenorhabditis elegans Protein Etkileşimleri Çalışması için

Aktif Caenorhabditis elegans'ın in vitro transkripsiyon için Nükleer Ekstrakt ve Rekonsitasyonu İzolasyonu

Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

Kombine nükleotit ve Caenorhabditis elegans Protein çekimi

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

Yaşlanma Sırasında Caenorhabditis elegans'ta Çözünmeyen Protein Agregasyonunun Yeni Bir Veriden Bağımsız Edinim İş Akışı ile Miktar Tayini

Yaşlanma Sırasında Caenorhabditis elegans'ta Çözünmeyen Protein Agregasyonunun Yeni Bir Veriden Bağımsız Edinim İş Akışı ile Miktar Tayini

Caenorhabditis elegans Genomik DNA'sının Küçük Ölçekli Ekstraksiyonu