Alessandra d'Azzo, Genetik ve Gen Terapisinde Çocuklar için Kuyumcular (JFC) Bağış Kürsüsüne sahiptir. Bu çalışma kısmen NIH hibeleri R01GM104981, RO1DK095169 ve CA021764, Memphis Assisi Vakfı ve Amerikan Lübnan Suriye İlişkili Hayır Kurumları tarafından desteklenmiştir.

Farelerdeki tüm prosedürler, St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzları tarafından onaylanan hayvan protokollerine göre gerçekleştirildi.
1. Çözümlerin ve ortamın hazırlanması
<ol><li>15.4 mL PBS'yi 2.5 mL 20 mg/mL kollajenaz P (5 mg/mL nihai konsantrasyon), 2 mL 11 U/mL dispas II (1.2 U/mL nihai konsantrasyon) ve 100 μL 1.0 MCaCl2 (5 mM nihai konsantrasyon) ile karıştırarak sindirim solüsyonu hazırlayın.</li>
	<li>440 mL DMEM'i 50 mL FBS (% 10), 5.0 mL kalem / strep (sırasıyla 100 U / mL ve 100 μg / mL) ve 5.0 mL glutamin takviyesi (2 mM) ile karıştırarak 500 mL primer fibroblast ortamı (DMEM tamamlandı) hazırlayın. Ortamı 0,22 μm gözenek boyutunda bir vakum filtresi ile filtreyle sterilize edin.</li>
	<li>FBS'nin 4 ° C'de 100.000 x g'de 38.5 mL polipropilen tüplerde gece boyunca ultrasantrifüj edilmesiyle eksozom içermeyen serum hazırlayın ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.</li>
	<li>440 mL DMEM'i 50 mL eksozomsuz serum (%10), 5 mL kalem/strep (100 U/mL ve 100 μg/mL) ve 5 mL glutamin takviyesi (2 mM) ile karıştırarak 500 mL eksozomsuz ortam hazırlayın. Ortamı 0,22 μm gözenek boyutunda bir vakum filtresi ile filtreyle sterilize edin.</li>
	<li>6.057 g Tris bazını 90 mLdH2Oiçinde çözerek ve pH'ı HCl ile 7.4'e ayarlayarak 0.5 M Tris-HCl (pH 7.4) hazırlayın.</li>
	<li>97.9 mLdH2Oile 2 mL 0.5 M Tris-HCl (pH = 7.4) ve 100 μL 1 M Mg(Ac)2 çözeltisi (sükroz çalışma çözeltisi) karıştırarak 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)/1 mM Mg(Ac)2 çözeltisi (sükroz çalışma çözeltisi) hazırlayın. Kullanmadan hemen önce çözeltiye proteaz inhibitörleri ekleyin ve çözeltiyi buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Tablo 1'e göre buz üzerinde sakaroz yoğunluk gradyan çözeltileri hazırlayın. Bu çözeltiler iki sükroz gradyan tüpü hazırlamak için yeterlidir.</li>
	<li>100 g TCA tozuna 40 mL dH2O ekleyerek %100 TCA hazırlayın ve tamamen eriyene kadar karıştırın. Son ses seviyesini dH2O ile 100 mL'ye ayarlayın.</li>
	<li>20 mL dH2O ile 80 mL %100 etanolü karıştırarak% 80 etanol hazırlayın.</li>
	<li>1.8 L dH2O ile 200 mL 10x çalışma tamponunu karıştırarak western blot çalışma tamponunu hazırlayın.</li>
	<li>1.4 L dH2O ile 200 mL 10x transfer tamponu ve 400 mL metanol karıştırarak western blot transfer tamponu hazırlayın. Transfer tamponunu 4 °C'ye önceden soğutun.</li>
	<li>122 g Tris bazı ve 180 g sodyum klorürü 850 mLdH2O(pH 8.0) içinde çözerek 20x Tris tamponlu salin (TBS) hazırlayın. Ses seviyesini dH2O ile 1 L'ye ayarlayın.</li>
	<li>5 g yağsız kuru sütü 1 mL %10 Tween-20, 5 mL 20x TBS ve 94 mL dH2O ile çözerek bloke edici tampon hazırlayın.</li>
	<li>3 g BSA'yı 1 mL %10 Tween-20, 5 mL 20x TBS ve 94 mL dH2O ile çözerek antikor tamponu hazırlayın.</li>
	<li>100 mL 20x TBS ve 20 mL %10 Tween-20 (10x) ile 1.88 LdH2O karıştırarak yıkama tamponu hazırlayın.</li>
	<li>1 hacim luminol/geliştir ile 1 hacim stabil peroksit tamponunu karıştırarak geliştirme solüsyonu hazırlayın.</li>
</ol>2. Gastroknemius (GA) fare kası diseksiyonu15,16
<ol><li>Buz üzerinde 10 mL PBS içeren 50 mL'lik tüpler hazırlayın.</li>
	<li>Fareleri bir CO2 odasında ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık yapın.</li>
	<li>Gastroknemius kasını her iki bacaktan çıkarın ve buz üzerinde PBS ile tüpe aktarın. NOT: GA kasını PBS'ye aktarmadan önce soleus kasını GA kasından çıkarın.</li>
</ol>3. Fare primer fibroblast izolasyonu ve kültürü
<ol><li>Kasları tartın ve biyogüvenlik başlığı altında 10 cm'lik bir tabağa aktarın. İnce bir macun haline gelene kadar kasları neşterle kıyın.</li>
	<li>İnce kıyılmış kas macununu 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve tüpe 3.5x hacim/mg doku sindirim solüsyonu ekleyin ve 37 °C'de 45 dakika inkübe edin. Süspansiyonu her 10 dakikada bir 5 mL'lik bir pipetle iyice karıştırın (bu, tamamen ayrışmaya yardımcı olacaktır). NOT: Alternatif olarak, bu adım için bir doku ayrıştırıcı kullanılabilir.</li>
	<li>Sindirim solüsyonunu etkisiz hale getirmek için hücre süspansiyonuna 20 mL DMEM ekleyin. 50 mL'lik bir tüp üzerine yerleştirilmiş 70 μm'lik bir naylon hücre süzgecine aktarın. Akışı toplayın ve hücre süzgecini ek 5 mL DMEM ile yıkayın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında (RT) 300 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Peletleri 10 mL DMEM complete'de yeniden süspanse edin ve hücreleri 10 cm'lik bir tabağa tohumlayın.</li>
	<li>Hücreleri 37 °C, %5 CO2, %3O2 (geçiş 0 veyaP0 ) ile kültürleyin. NOT: 1) Fizyolojik benzeri koşulları sağlamak için bu kültürlerin düşük oksijen seviyesinde tutulması gerekir (iskelet kasındaO2 seviyesi yaklaşık% 2.5'tir)17. 2) Bir hücre kültürünün geçiş numarası (örneğin, P0), kültürün kaç kez alt kültürlendiğinin bir kaydıdır. 3) P0'daki primer fibroblastlar, %100 birleşme artı 1 güne kadar (ve sadece P0 için) rutin olarak kültürlenir. Bu, diğer hücre tiplerini temizlemek ve kültürde bulunan hücrelerin, mikroskop incelemesine dayalı olarak miyojenik hücrelerden tükenmiş sadece fibroblastlar olduğundan emin olmak içindir. 2 aylıkken yetişkin bir hayvandan alınan iskelet kası yaklaşık% 2 miyojenik progenitöriçerir 4. Ek olarak, miyojenik progenitörler genellikle kaplanmamış bulaşıklara yapışmaz; bu nedenle, 18,19,20 alt kültürleme sırasında kaybolurlar. Miyojenik hücreler, %20 FBS ve bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF)18 ile desteklenmiş farklı bir ortam (F10) gerektirir. DMEM complete'de, orta fibroblastlar, miyojenik hücrelerden daha yüksek bir proliferasyon hızına sahiptir, bu da bu kirletici hücrelerin ilk geçişten önce ortadan kaldırılmasıyla sonuçlanır.</li>
	<li>P0 hücrelerini% 100 birleştiğinde artı 1 gün PBS ile durulayın. 1 mL tripsinizasyon çözeltisi ekleyin ve hücreleri ayırmak için 37 °C, %5CO2, %3O2'de inkübe edin. 10 mL DMEM complete kullanarak enzimatik aktiviteyi durdurun.</li>
	<li>Hücreleri RT'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve peleti 20 mL DMEM içinde yeniden süspanse edin ve 15 cm'lik bir tabağa tohumlayın (pasaj 1 veya P1). Hücreler %80-90 birleşene kadar büyütülür ve 3. geçişe kadar genişletilebilir. NOT: Aşağı akış deneylerine bağlı olarak geçit 1, geçit 2 (P2) veya geçit 3 (P3) kullanılabilir.</li>
</ol>4. Hücrelerin tohumlanması ve şartlandırılmış ortamın toplanması
<ol><li>Fibroblastları (P1, P2 veya P3) 10 mL PBS ile yıkayın, hücrelere 2.5 mL tripsinizasyon solüsyonu ekleyin ve 37 °C, %5 CO2, %3O2'de inkübe edin. 10 mL DMEM complete kullanarak enzimatik aktiviteyi durdurun. NOT: 4. geçişten sonra, birincil hücreler atılır ve özelliklerini değiştirdikleri için daha fazla deney için kullanılmamalıdır.</li>
	<li>Hücreleri toplayın ve 10 dakika boyunca RT'de 300 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Hücre peletini 10 mL eksozomsuz ortamda yeniden süspanse etti ve hücreleri saydı.</li>
	<li>Hücreleri tabak başına 1.5–2.0 x 106 hücrede (15 cm) tohumlayın ve 37 °C, %5 CO2, %3O2'de inkübe edin.</li>
	<li>Şartlandırılmış ortamı 16-24 saat arasında 50 mL'lik tüplerde buz üzerinde toplayın. NOT: Hücreler %80 birleşik değilse, taze ekzozomal serbest ortam tekrar eklenebilir ve 16-24 saatlik ek bir süre sonra toplanabilir. İki koleksiyon daha sonraki işlemler için birleştirilebilir.</li>
</ol>5. Diferansiyel ve ultra santrifüjleme kullanılarak eksozomların saflaştırılması
NOT: Tüm adımlar 4 °C'de veya buz üzerinde gerçekleştirilir. Gerektiğinde tüpü suyla dolu bir tüp ile dengeleyin.
<ol><li>Canlı hücrelerin çıkarılması için şartlandırılmış ortamı 300 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir 50 mL tüpe aktarın.</li>
	<li>Ölü hücreleri 10 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyerek çıkarın ve süpernatanı 38.5 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın.</li>
	<li>Organellerin, apoptotik cisimlerin ve membran parçalarının çıkarılması için süpernatanı 10.000 x g'da 30 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 38.5 mL ultra berrak bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Eksozomları peletlemek için süpernatanı 1.5 saat boyunca 100.000 x g'da ultrasantrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı dikkatlice atın, yaklaşık 1 mL şartlandırılmış ortam bırakın ve eksozom peletini toplam 30 mL buz gibi soğuk PBS hacminde yıkayın.</li>
	<li>1,5 saat boyunca 100.000 x g'da santrifüjleyin ve ekzozomal peleti bozmamaya dikkat ederek süpernatanı pipetleyerek dikkatlice atın.</li>
	<li>Peletleri buz gibi soğuk PBS'de (15 cm'lik çanak başına ~ 25 μL) yeniden süspanse edin ve BCA protein test kiti ve 562 nm'de bir mikroplaka okuyucu kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün. NOT: Protein konsantrasyonu, dH2O'da %0.1 Triton-X100 ile 1:2seyreltme ile ölçülür. % 80 birleşmede 15 cm'lik bir tabaktan (20 mL şartlandırılmış ortam) primer fibroblastlardan eksozom verimi ~ 3-4 μg'dir.</li>
</ol>6. Eksozomların sükroz yoğunluk gradyanı ile karakterizasyonu
<ol><li>Aşağıdakileri pipetleyerek (aşağıdan yukarıya) sakaroz gradyanını 13 mL ultra berrak bir tüpe yükleyin: 1.5 mL 2.0 M, 2.5 mL 1.3 M, 2.5 mL 1.16 M, 2.0 mL 0.8 M ve 2.0 mL 0.5 M sükroz çözeltileri.</li>
	<li>30-100 μg eksozomları 0.25 M sükroz çözeltisi ile karıştırın ve hacmi 1 mL'ye ayarlayın.</li>
	<li>Eksozomları gradyanların üzerine dikkatlice yükleyin ve numuneleri 100.000 x g ve 4 °C'de 2,5 saat boyunca ultra santrifüjleyin.</li>
	<li>Tüpleri ultra santrifüjden çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin ve gradyanın tepesinden başlayarak 1.0 mL'lik fraksiyonları toplayın. Bunları buz üzerinde 1.7 mL'lik tüplere aktarın.</li>
	<li>Her tüpe 110 μL %100 TCA ekleyin, iyice karıştırın ve RT'de 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>10.000 x g'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice atın.</li>
	<li>Peleti 500 μL önceden soğutulmuş %80 etanol içinde yeniden süspanse edin ve numuneleri -20 °C'de 10 dakika yıkamaya bırakın.</li>
	<li>10.000 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
	<li>Peletleri RT'de 10-15 dakika kurutun ve in vitro deneyler için peleti PBS'de yeniden süspanse edin. BCA protein test kitini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün veya peleti doğrudan 14.5 μL dH2O, 5 μL 4x Laemmli tamponu ve western blot analizleri için 0.5 μL 1 M DTT içinde yeniden süspanse edin.</li>
</ol>7. Batı leke analizi ile eksozom tespiti
<ol><li>Adım 5.7'den 5-10 μg eksozomları 5 μL 4x Laemmli tamponu ve 0.5 μL 1 M DTT ile karıştırın, ardından son hacmi dH2O ile 20 μL'ye ayarlayın. Adım 6.9'dakiler de dahil olmak üzere tüm numuneleri 98 °C'de 5 dakika ısıtın.</li>
	<li>Numuneleri %10 TGX lekesiz bir jele yükleyin ve protein merdivenlerini üreticinin tavsiyelerine göre yükleyin. NOT: İlgilenilen proteinin moleküler ağırlığına göre jelin yüzdesini seçin.</li>
	<li>Jeli, yükleme boyası jelin dibine gelene kadar ~ 1 saat boyunca çalışan tamponda 100 V'ta çalıştırın. NOT: Çalışma süresi, kullanılan ekipmana veya jelin türüne ve yüzdesine göre değişebilir.</li>
	<li>Jeli görüntüleyin. Leke tutmayan jellerin görüntüleri, immünoblotlar için yükleme kontrolü olarak kullanılır.</li>
	<li>Jeli bir PVDF membranı kullanarak 80 V'ta 1,5 saat veya gece boyunca 4 °C'de 30 V'ta aktarın.</li>
	<li>Membranları RT'de 1 saat boyunca bloke edici tamponda bloke edin.</li>
	<li>Spesifik antikorlar için membranları (Tablo 2) antikor tamponunda gece boyunca 4 ° C'de çalkalama ile inkübe edin.</li>
	<li>Membranları yıkama tamponunda yıkayın ve membranları uygun ikincil antikorlarla (Tablo 2) RT'de 1 saat çalkalama ile inkübe edin.</li>
	<li>Membranları yıkama tamponunda yıkayın ve membranları geliştirme solüsyonu ve kamera tabanlı bir görüntüleyici kullanarak görüntüleyin. Alternatif olarak, membranları geliştirmek için bir X-ışını filmi kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Extracellular+Vesicles,+Their+Origin,+Composition,+Purpose,+and+Methods+for+Exosome+Isolation+and+Analysis.">Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+Isolation,+Characterization,+Biological+Function,+and+Multifarious+Therapeutic+Approaches+of+Exosomes.">Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes.</a> Cells. 8 (4), 307 (2019).</li><li>Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+biogenesis,+biologic+function+and+clinical+potential.">Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential.</a> Cell &amp; Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).</li><li>van de Vlekkert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+exosome+release+is+the+pathogenic+pathway+linking+a+lysosomal+deficiency+to+generalized+fibrosis.">Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis.</a> Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).</li><li>Rackov, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vesicle-Mediated+Control+of+Cell+Function:+The+Role+of+Extracellular+Matrix+and+Microenvironment.">A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment.</a> Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).</li><li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+the+pathology+of+neurodegenerative+diseases.">Exosomes in the pathology of neurodegenerative diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li><li>Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+vesicles+in+renal+fibrosis.">The role of extracellular vesicles in renal fibrosis.</a> Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).</li><li>Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+role+of+extracellular+vesicles+and+exosomes+in+the+pathogenesis+of+cystic+fibrosis.">Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis.</a> Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).</li><li>Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+exosomes+in+liver+physiology+and+pathology.">Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology.</a> Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).</li><li>Machado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+lysosomal+exocytosis+mediates+cancer+progression.">Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression.</a> Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).</li><li>Tian, W., Liu, S., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+exosomes+in+cancer+metastasis.">Potential role of exosomes in cancer metastasis.</a> Biomed Research International. , 4649705 (2019).</li><li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+disease.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease.</a> Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).</li><li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield,+purity+and+downstream+applications.">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).</li><li>Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., Gonz&#225;lez-Valdez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+challenges+in+the+recovery+and+purification+of+cellular+exosomes.">Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes.</a> Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mitochondria+from+Minimal+Quantities+of+Mouse+Skeletal+Muscle+for+High+Throughput+Microplate+Respiratory+Measurements.">Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).</li><li>. Muscle Dissection in mouse Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8">https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8</a> (2016)</li><li>Mas-Bargues, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+oxygen+concentration+in+stem+cell+culture+for+regenerative+medicine.">Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).</li><li>Bois, P. R., Grosveld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKHR+(FOX01a)+is+required+for+myotube+fusion+of+primary+mouse+myoblasts.">FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts.</a> The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).</li><li>Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+rat+muscle+progenitor+cells+have+decreased+proliferation+and+myotube+formation+during+passages.">Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages.</a> Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+tissue+engineering.">Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).</li></ol>

Yazarların hiçbirinin beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu protokolde belirtildiği gibi, eksozomların kültür ortamından başarılı bir şekilde izole edilmesi için kritik bir adım, yetişkin iskelet kasından birincil fare fibroblast kültürlerinin uygun şekilde kurulması ve sürdürülmesidir. Fizyolojik benzeri koşulları sağlamak için bu kültürlerin düşük oksijen seviyesinde tutulması gerekir (iskelet kasındakiO2 seviyesi ~%2.5'tir)15. Primer fibroblastlar kültürde çok fazla geçtiğinde özellik değiştirecektir....

Eksozomlar, boyutları 30-150 nm arasında değişen heterojen hücre dışı veziküllerdir. Doku ve organlardaher yerde dağılımları göz önüne alındığında, fizyolojik ve patolojik süreçlerde kilit oyunculardır 1,2. Eksozomlar, türetildikleri hücrelerin tipine göre değişen karmaşık bir protein, lipit, DNA tipi ve RNA tipi kargosu taşırlar 1,2,3. Eksozomlar, farklı işlevlere sahip proteinlerle zenginleştirilmiştir (yani, CD9 ve CD63 dahil tetraspaninler) füzyon olaylarından sorumludur. Örneğin, ısı şoku proteinleri HSP70 ve HSP90, antijen bağlanması ve sunumunda rol oynar. Ek olarak, Alix, Tsg101 ve flotilin, eksozom biyogenezi ve salınımına katılır ve bu nanoveziküllerin 2,3,4 belirteçleri olarak yaygın olarak kullanılır.
Eksozomlar ayrıca, aşağı akış sinyalinietkiledikleri alıcı hücrelere aktarılabilen çeşitli RNA'lar (yani mikroRNA'lar, uzun kodlamayan RNA'lar, ribozomal RNA'lar) içerir 3. Tek bir birim zarla çevrili olan eksozom biyoaktivitesi, yalnızca proteinlerin ve nükleik asitlerin kargosuna değil, aynı zamanda sınırlayıcı zarın1 lipit bileşenlerine de bağlıdır. Ekzozomal membranlar, fosfatidilserin, fosfatidik asit, kolesterol, sfingomyelin, araşidonik asit ve diğer yağ asitleri açısından zenginleştirilmiştir ve bunların tümü eksozom stabilitesini ve membran topolojisinietkileyebilir 2,3. Kargo ve lipid düzenlemesinin bir sonucu olarak, eksozomlar alıcı hücrelerde sinyal yollarını başlatır ve normal doku fizyolojisininkorunmasına katılır 1,2,4,5. Belirli patolojik koşullar altında (ör., nörodejenerasyon, fibroz ve kanser), patolojik uyaranları tetikledikleri ve yaydıkları gösterilmiştir 4,6,7,8,9,10,11.
Sinyalleri komşu veya uzak bölgelere yayma yetenekleri nedeniyle, eksozomlar, hastalık durumlarının teşhisi veya prognozu için değerli biyobelirteçler haline gelmiştir. Ek olarak, eksozomlar deneysel olarak terapötik bileşiklerin araçları olarak kullanılmıştır 2,12. Bu nanoveziküllerin klinikte potansiyel uygulaması, maksimum verim, saflık ve tekrarlanabilirlik elde etmek için izolasyon yöntemini giderek daha önemli hale getirmektedir. Eksozomların izolasyonu için farklı teknikler geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Genel olarak, eksozomlar, diferansiyel santrifüjleme, boyut dışlama kromatografisi ve bağışıklık yakalama (ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak) ile şartlandırılmış hücre kültürü ortamından veya vücut sıvılarından izole edilebilir. Her yaklaşımın daha önce tartışılan benzersiz avantajları ve dezavantajları vardır 1,2,13,14.
Ana hatlarıyla belirtilen protokol, 1) yetişkin fare gastroknemius kasından primer fibroblastların izolasyonu ve kültürüne ve 2) bu hücreler tarafından kültür ortamına salınan eksozomların saflaştırılmasına ve karakterizasyonuna odaklanmaktadır. Fonksiyonel çalışmalar için eksozomların primer fibroblastlardan izolasyonu için iyi kurulmuş bir protokol şu anda eksiktir. Primer fibroblastlar büyük miktarlarda eksozom salgılamaz, bu da izolasyon ve saflaştırma sürecini zorlaştırır. Bu protokol, morfolojik bütünlüklerini ve fonksiyonel aktivitelerini korurken büyük kültür hacimlerinden büyük miktarlarda saf eksozomların saflaştırılmasını açıklar. Şartlandırılmış ortamdan elde edilen saflaştırılmış eksozomlar, alıcı hücrelerde spesifik sinyal yollarını indüklemek için in vitro alım deneylerinde başarıyla kullanılmıştır. Ayrıca, birden fazla biyolojik örnekten alınan ekzozomal kargoların karşılaştırmalı proteomik analizleri için de kullanılmıştır4.

<table><tbody><tr><td>10 cm dishes</td><td>Midwest Scientific, TPP</td><td>TP93100</td><td></td></tr><tr><td>15 cm dishes</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP93150</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin Fraction V</td><td>Roche</td><td>10735094001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11</td><td>Eppendorf</td><td>022620659/5427754008</td><td></td></tr><tr><td>Chemidoc MP imaging system</td><td>BioRad</td><td>12003154</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Sigma, Roche</td><td>11 213 857 001</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>cOmplete protease inhibitor cocktail</td><td>Millipore/Sigma, Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Criterion Blotter with plate electrodes</td><td>BioRad</td><td>1704070</td><td></td></tr><tr><td>Criterion TGX stain-free protein gel</td><td>BioRad</td><td>5678034</td><td>10% 18-well, midi-gel</td></tr><tr><td>Criterion vertical electrophoresis cell (midi)</td><td>BioRad</td><td>NC0165100</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma, Roche</td><td>04 942 078 001</td><td>neutral protease, grade II</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma/Millipore, Roche</td><td>10708984001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modification Eagles Medium</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Pharmco by Greenfield Global</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL conical centrifuge tubes</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Fluostar Omega multi-mode microplate reader</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P Transfer membranes</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli sample buffer (4x)</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium acetate solution</td><td>Sigma</td><td>63052-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>LabScientific</td><td>M-0842</td><td></td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Sanyo</td><td>MC0-18M</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td>10,000 U/ml</td></tr><tr><td>Premium microcentrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific, Midwest Scientific</td><td>AVSC1510</td><td>1.7 mL</td></tr><tr><td>Protected disposable scalpels</td><td>Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Running buffer</td><td>BioRad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system</td><td>Millipore</td><td>S2GPU05RE</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Sterile cell strainer (70 mm)</td><td>Fisher Scientific, Fisher brand</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal west Femto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34096</td><td></td></tr><tr><td>Thin wall Polypropylene tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Transfer buffer</td><td>BioRad</td><td>16110734</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic Acid</td><td>Sigma</td><td>91228-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>BioRad</td><td>1610719</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100 solution</td><td>Sigma</td><td>93443-100mL</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>12604-013</td><td>No phenol red</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioRad</td><td>#1610781</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-centrifuge Optima XPM</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99842</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-clear tube (14x89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-clear tubes (25x89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Water bath Isotemp 220</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS220</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of exosomes from skeletal muscle fibroblasts

Eksozomlar, hemen hemen tüm hücreler tarafından salınan ve tüm biyolojik sıvılarda salgılanan küçük hücre dışı veziküllerdir. Bu veziküllerin izolasyonu için ultrasantrifüjleme, ultrafiltrasyon ve boyut dışlama kromatografisi dahil olmak üzere birçok yöntem geliştirilmiştir. Bununla birlikte, hepsi büyük ölçekli eksozom saflaştırması ve karakterizasyonu için uygun değildir. Burada özetlenen, yetişkin fare iskelet kaslarından izole edilen primer fibroblast kültürlerinin oluşturulması için bir protokoldür, ardından bu hücrelerin kültür ortamından eksozomların saflaştırılması ve karakterizasyonu yapılır. Yöntem, sıralı santrifüjleme adımlarının ve ardından sakaroz yoğunluk gradyanlarının kullanımına dayanmaktadır. Ekzozomal preparatların saflığı daha sonra bir dizi kanonik belirteç (yani, Alix, CD9 ve CD81) kullanılarak western blot analizleri ile doğrulanır. Protokol, elektron mikroskobu, kütle spektrometrisi ve fonksiyonel çalışmalar için alım deneyleri için biyoaktif eksozomların nasıl izole edileceğini ve konsantre edileceğini açıklar. Kolayca büyütülebilir veya küçültülebilir ve farklı hücre tiplerinden, dokulardan ve biyolojik sıvılardan eksozom izolasyonu için uyarlanabilir.

Bu protokol, eksozomların büyük hacimlerde şartlandırılmış ortamdan uygun maliyetli bir şekilde saflaştırılması için uygundur. Prosedür son derece tekrarlanabilir ve tutarlıdır. Şekil 1 , fare primer fibroblastlarının kültür ortamından saflaştırılan eksozomların transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüsünü göstermektedir. Şekil 2 , kanonik ekzozomal belirteçlerin protein ekspresyon modelini ve sitozolik (LDH) ve ER (kalnek...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts at JoVE.com

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Bu protokol, 1) yetişkin fare gastroknemius kasından primer fibroblastların izolasyonunu ve kültürünü ve ayrıca 2) sükroz yoğunluk gradyanları ile birlikte diferansiyel bir ultrasantrifüj yöntemi kullanılarak eksozomların saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu ve ardından western blot analizlerini göstermektedir.

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

isolation-characterization-exosomes-from-skeletal-muscle

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

3.3K Görüntüleme.  St. Jude Children's Research Hospital. Bu protokol, 1) yetişkin fare gastroknemius kasından primer fibroblastların izolasyonunu ve kültürünü ve ayrıca 2) sükroz yoğunluk gradyanları ile birlikte diferansiyel bir ultrasantrifüj yöntemi kullanılarak eksozomların saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu ve ardından western blot analizlerini göstermektedir.

Video: Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

İskelet Kas Biyopsisi Prosedüründen İnsan Kas Atası Hücrelerinin İzolasyon, Kültür, Karakterizasyonu ve Farklılaşması

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

Fare İskelet Kas Ekstranında Primer Miyoblastların İzolasyon ve Farklılaşması

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Tıp

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

<meta charset="utf8"></head><body>Murin Dalak Kaynaklı Eksozom İzolasyonu için Rafine Etme Teknikleri

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed that Exo derived from humoral or cell-supernatant are promising targets for novel diagnostic or prognostic biomarkers, underscoring their significant role in disease pathogenesis. Tissue-derived Exo (Ti-Exo) have attracted increasing attention due to its ability to accurately reflect tissue specificity and the microenvironment. Ti-Exo, present in interstitial space, play crucial roles in intercellular communication and cross-organ signaling. Despite their recognized value in elucidating disease mechanisms, isolating Ti-Exo remains challenging due to the complexity of tissue matrices and variability in extraction methods. In this study, we developed a practical protocol for isolating exosomes from mice spleen tissue, providing a reproducible technique for subsequent identification analysis and functional studies. We used Type I collagenase digestion combined with differential ultracentrifugation to isolate spleen-derived Exo. The characteristics of isolated Exo were determined through electron microscopy, the nano-flow cytometer, and the western blot. The isolated spleen-derived Exo displayed the typical morphology of lipid bilayer vesicles, with particle sizes ranging from 30 nm to 150 nm. In addition, the expression profile of exosome markers confirmed the presence and purity of exosomes. Taken together, we successfully established a practical protocol for isolating spleen-derived Exo in mice.

<meta charset="utf8"></head><body>Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Here, we present a protocol to isolate mouse spleen-derived exosomes using a combination of digestion with collagenase type I and ultracentrifugation.

Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed ...

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

İskelet Kas Biyopsisi Prosedüründen İnsan Kas Atası Hücrelerinin İzolasyon, Kültür, Karakterizasyonu ve Farklılaşması

Fare İskelet Kas Ekstranında Primer Miyoblastların İzolasyon ve Farklılaşması

RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu