Parietal epitel hücrelerinaktivasyonu böbrek glomerulusunda skar dokusunun gelişiminde önemli bir faktördür. Bu yöntemi kullanarak, bu aktivasyondahil hücresel süreçleri inceleyebilir ve umarım yavaşlatmak ve hatta hastalığın ilerlemesini durdurmak için tedavi seçenekleri bulabilirsiniz. Tekniğimizin en büyük avantajı izole glomerülden düz büyüyen birincil hücreleri kullanmamızdır.
Böbrekler serbest sonra, metin el yazması nda belirtildiği gibi, cerrahi forceps ile böbrek tutun ve böbrek kapsülleri koparmak için başka bir çift forceps kullanın. Bundan sonra, her biri iki mililitre HBSS içeren altı kuyu kültür plakasının kuyularına böbrekleri yerleştirin ve kültür plakasını buza yerleştirin. İlk olarak, 100 milimetre Petri çanak böbrekler aktarın ve yaklaşık bir ila iki milimetre küçük parçalar halinde kıyma için iki neşter kullanın.
Kıyılmış böbrek parçalarını HBSS ile ıslak tutun. Daha sonra, 300 mikrometrelik metal elek üstüne böbrek parçaları yerleştirin ve 20 mililitreşır dan piston kullanarak elek ile böbrek basın. Elek arasında HBSS ile tekrar tekrar durulayın ve akan ve temiz bir Petri kabına aktarmak için serolojik bir pipet kullanın.
Elek altında kalan her şeyi kazımak ve toplanan böbrek homojen aktarmak için bir neşter kullanın. HBSS ile 75 ve 53 mikrometre elek ile homojen böbrek durular. Daha sonra, küçük yapıların tümkaldırmak için HBSS ile her iki elek yıkayın.
%20 fetal buzağı serumu ile desteklenen DMEM ile her birinin üst yüzeyini yıkayarak eleklerde kalan böbrek yapılarını ve malzemeyi toplayın ve malzemeyi altı adet ultra düşük ek mikroplakanın kuyularına aktarın. Ultra-düşük eki mikroplakayı ters ışık mikroskobuna getirin ve 20 mikrolitrelik pipet kullanın tek kapsüllü ve veya decapsulated glomeruli toplayın. Pipet ucunda tek bir glomerulus yakaladıktan sonra, 20 mikrolitre lik bir hacme aynı pipet ucuna toplanan böbrek malzemesi olmadan taze DMEM ortamı ekleyin.
DMEM ortamı ile tek glomerülü 24 kuyulu hücre kültür plakasının bir kuyunun merkezine aktarın ve glomerulusun kuyunun merkezine bağlanmasını sağlamak için üç saat boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede inkübatın. Kuluçkadan sonra glomerulus kuyunun merkezine iliştirilir. Dikkatle bir büyüme faktörü kiti ve ek bir% 5 FBS ve% 1 penisilin ve streptomisin her kuyuya takviye endotel Bazal orta 500 mikrolitre ekleyin.
Kültür tek glomeruli 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile altı gün boyunca. Kuluçka altı gün sonra, görüntüleri almak ve glomerüler büyüme analiz etmek için bir dijital ters ışık mikroskobu kullanın. Bir görüntü analizi yazılımı kullanarak, bir ölçek çubuğu ile görüntü dosyalarından birini açarak glomerüler outgrowth yüzey alanını belirlemek.
Ölçek çubuğuna düz bir çizgi çizin ve Analiz et'e tıklayın, ardından piksellerin uzaklıklarını belirlemek için ölçün. Ölçeği belirlemek için Çözümle ve Ölçeği Ayarla'yı tıklatın ve piksellerde bilinen uzaklığı, bilinen uzaklığı ve uzunluk birimini girdi. Bittiğinde Tamam'ı tıklatın.
Analiz et ve Ölçümleri Ayarla'ya tıklayın. Ardından, Alan ve Görüntü Etiketi seçeneklerini kontrol edin. Bittiğinde Tamam'ı tıklatın.
Sonra, glomerüler büyüme etrafında bir serbest seçim çizin. Daha önce belirlenen ölçekte büyümenin yüzey alanını içeren bir sonuç tablosunu görüntülemek için Çözümle ve ölçü'ye tıklayın. Bu çalışmada kapsüllü glomeruli glomeruli glomerüler parital epitel hücre outgrowths fare böbrekler izole edilir, kültürlü, ve analiz.
Temsili ışık mikroskobu görüntüleri, glomerulus fare böbreklerinden izole olduktan sonra kültür sırasında farklı zaman noktalarında glomerüler çıkıntılar göstermektedir. Büyüyen hücrelerin parietal epitel hücreleri olduğunu doğrulamak için, decapsulated glomeruli de izole ve altı gün boyunca kültürlü. Decapsulated glomeruli bu kuluçka döneminde hiçbir hücre büyüme gösterir.
İmmünofloresan boyama sonra farklı parietal epitel hücre belirteçleri için yapılır, fotoğraf sitesi özel belirteçleri, yanı sıra endotel hücre belirteçleri. Sonuçlar, büyüyen hücrelerin parietal epitel hücreleri olduğunu doğrular. CD44 nakavt farelerden ilişkili glomeruli, yabani tip farelerden izole edilen glomeruli ile karşılaştırıldığında azalmış bir glomerular outgrowth yüzey alanının yanı sıra büyüyen hücrelerin azalmış bir sayı olduğunu göstermektedir.
Bu parietal epitel hücre aktivasyonuNDA CD44 için önemli bir rol düşündürmektedir. Bu tekniği kullanarak, parietal epitel hücre aktivasyonu ilaçlar üzerindeki etkilerini incelemek de mümkündür. Bu seçtiğiniz ilaç ile izole glomeruli tedavi ve hücre büyümesi ve hücre göçü farklılıkları analiz etmek için yapılabilir.
