Bu protokol Pseudomonas aeruginosa genomunda zihin-beden istenilen mutasyonların oluşturulması ve belirlenmesi için önemlidir, yanı sıra tekrarlanabilir bir fare modelinde virülans azaltma mutasyonların etkisini test. Bu tekniğin en önemli avantajı krom doğrulama ve fare enfeksiyonu modelinin tekrarlanabilirliğidir. Bakteriler sürekli çalışıyor, sürekli değişiyor.
Bu işlemi yavaşlatmak için, dondurulmuş bir durak kullanıyoruz, onları paketliyoruz, fare modelinde test etmeden önce modifikasyonda birden fazla basamak üzerine asıyoruz. Bu yöntemlere aşina olmayan biri büyük olasılıkla geliştirme ve olası crossover rekombinant seçimi ile test etmek için mücadele edecektir. Ayrıca, enfeksiyon için farelerin kullanımı hayvan çalışmaları yabancı biri için zor olacaktır.
Bu yöntem diğer patojenlerin ve mutantlarının test edilmesinde ve farelerde virülans bulaşmasıiçin uygulanabilir. Mevcut modeller ile karşılaştırıldığında, tekrarlanabilirlik artı enfeksiyon öncesi ve sonrası klon doğrulama ile prosedürler alanında diğer araştırmacılar yararlanabilir. Bu protokolün görsel gösterimi, tek başına okuma yoluyla anlaşılması veya anlaşılması zor olabilecek kapsamlı prosedürlere içgörü sağlar.
Pseudomonas Isolation Broth veya PIB tek crossover, rekombinant koloniler büyüyerek başlayın. Aşılamak ve her kültürün 10 mikrolitre önceden ısıtılmış PIA plakaları üzerine, 10% sakaroz ile takviye. Sonra tabakları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, kuvözden plakaları çıkarın ve büyüme için onları kontrol edin. Sakarozdirençli koloni çift crossover rekombinantlar olmalıdır. Pia önceden ısıtılmış plakalar üzerine en az 20 kolonileri yama steril kürdan kullanın, PIA ile takviye 10%sakaroz, ve PIA carbenicillin ile desteklenmektedir.
Bir gecede plakaları kuluçkaya yatırın ve ertesi gün büyüme için inceleyin. Gerçek çift crossover rekombinantlar karbenicillin duyarlı ve sakaroz dirençli olacaktır. Kolonya PCR kullanarak silme için 10 ila 20 koloniyi ekran.
Steril bir kürdan ile şüpheli bir çift crossover rekombinant büyüme pick up ve PBS 50 mikrolitre askıya. Süspansiyonu 100 derecede 10 dakika kaynatın. 13,000 kez G'de üç dakika santrifüj edin ve buza yerleştirin.
Daha sonra, el yazması talimatlara göre PCR gerçekleştirin. PCR tamamlandıktan sonra, ürünler üzerinde Agarose jel elektroforez gerçekleştirin. Daha küçük amplifikasyon ürünleri, ilgi alanının silindiği kolonileri gösterir.
Enjeksiyonsabahı, bakteri hücrelerinin cryovials dört santigrat üç ila dört saat boyunca çözülür. Şişeleri erittikten sonra buzda tutun ve farelere iki saat içinde enjekte edin. Her cryovial içeriğini yeni bir iki mililitrelik tüp ve santrifüj için 4, 500 kez G 10 dakika aktarın.
Supernatant atın ve pbs bir mililitre hücre pelet yeniden askıya. Santrifüjü tekrarlayın ve PBS'deki hücreleri mililitrede 9 koloni oluşturan ünitelere 2,5 kat 10'luk son konsantrasyona kadar yeniden askıya alın. Konsantrasyonu, genotipi ve fenotipi doğrulamak için her suş son süspansiyon üç örnek alın.
Her zorlanma için, iki mililitrelik bir tüp içine hücre süspansiyon 1.5 mililitre aliquot ve kontrol enjeksiyonları için PBS hazırlamak. Steril bir hayvan cerrahi odasında enjeksiyonlar için gerekli fare ve malzemeleri toplayın ve başlamadan önce dezenfekte mendil ile tüm yüzeyleri silin. Isırılırsa delinme riskini sınırlamak için iki çift lateks eldiven, laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlükleri ve yüz maskesi giyin.
Fareyi kafesten çıkarın ve tartının, kuyruk işaretini enjeksiyon sonrası izleme için kalıcı marker ile işaretleyin. 27 gauge iğne ile yeni bir mililitreşşü açın ve 200 mikrolitre steril PBS çekin. Başparmağı ve işaret parmağını kullanarak fareyi kulaklarının arkasından yakalayın ve ensede bir deri kıvrımı oluşturmak için çimdiklayın.
Daha sonra, fare düz ve hareketsiz tutmak için serçe parmağı kullanarak avuç içine kuyruk güvenli. İğneyi 30 derecelik bir açıyla orta hattın solundaki veya sağına periton boşluğuna yerleştirin. Organlara takılmadığından emin olmak için iğneyi hafifçe kaldırın.
Sonra, yavaş yavaş PBS enjekte ve iğne çekin. Enjeksiyon yerinde bir bolus tipiktir. İğneyi belirlenen keskinlik leri imha kabına yerleştirin ve fareyi ayrı bir kafese taşıyın.
Bir sonraki fare ile prosedürü tekrarlayın ve bir kafesteki tüm fareler enjekte edildikten sonra, onları orijinal kafesine geri taşıyın. Kontrol grubuna enjekte ettikten sonra, aynı prosedürü kullanarak test gruplarına enjekte edin. Tüm enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, fareleri barınma odasına geri getirin ve çalışma alanını dezenfekte mendillerle temizleyin.
Hayvanları görüntülemek için, kamera parametrelerini ayarlayarak ve sahneyi ısıtarak görüntüleme sistemini hazırlayın. Oksijen akışını dakikada 1,5 litreye ve izofluranı %3,5'e ayarlayın ve fareyi anesteziden sonra sabitlenen sıcaklık aşamasına, anestezi odasına taşıyın. Fareyi kollarını uzatarak sırtına yerleştirin ve görüntüleme sırasında %2,5 izofluran uygulanması için bir burun konisi sığdırın.
Kapıyı kapatın ve farenin biyolüminesans görüntülerini ve röntgenlerini alın. Görüntüleme tamamlandığında fareyi kafesine geri döndürün ve izleyin. 3-5 dakika içinde kendine gelecek.
Hedeflenen genomik silmeler, ilgi bölgesini güçlendiren özel astarlarla koloni PCR tarafından doğrulandı. Genomik silme ile koloniler yabani tip kolonilere göre daha kısa bir PCR bandı verim. P aeruginosa zayıflatılmış suşu intraperitoneal enjeksiyon, PGN beş, 0% mortalite ile sonuçlandı, E.coli BL ile gözlenen mortaliteye eşdeğer 21.
Ancak ebeveyn türünün enjeksiyonu farelerin %80'ine göre ölümcüldü. Enfeksiyon progresyonu biyolüminesans işaretli ebeveyn ve zayıflatılmış suşlar kullanılarak izlendi. Zayıflatılmış suşu, biyolüminesans solana kadar enjeksiyon yerinde lokalize olarak kaldı, ki bu da büyük olasılıkla enfeksiyonun temizlenmesiyle çakıştı.
Sunulan yöntem sadece suş tarafından üretilen mortalite incelenmiştir. Daha derinlemesine immünolojik ve toksikolojik yönleri enfeksiyon dinamikleri ve enfeksiyon ölümle sonuçlanmaz son etkisi belirlemek için kullanılabilir. Prosedürdeki en önemli şey, ilk tanımlamadan hayvan testlerine kadar çeşitli adımlar arasında yapılan kapsamlı doğrulamadır.
Test edilen suşlar mutasyon alabildiği veya kontamine olabileceğinden, belirli doğrulama adımlarının eksik olması potansiyel olarak yanlış sonuca yol açabilir. Bu iki tekniğin geliştirilmesi ile, bu enfeksiyon immünoloji alanında araştırmacılarımızın daha etkili nasıl güçlü paket etkileşimaşırı fenotip, sepsis ve mortalite yol açtığını araştırmak için izin olacağını düşünüyorum. Farklı besinlerin varyantlar üzerindeki etkisi bakterilerin boyut dosing ilerleyerek karşılaştırılabilir.
