Taramalı elektron mikroskobu kullanılarak boyalı kaplumbağa embriyolarının, sert yumurta kabuklarının ve mantar kültürlerinin görüntülenmesi için standart örnek hazırlama protokollerimiz bulunmaktadır. Bu kapsamlı yöntemler, orijinal yapılar ve eserler işleme arasındaki ayrım sağlayan üç hassas dokuları işlemek için bilinen protokollerde ince değişiklikler kullanın. Prosedürü benimle birlikte göstermek Jessica Gibbons olacak, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi.
Yuvalama mevsiminde bir tarla dan kaplumbağa yumurtatoplamadan önce, havalandırma izin vermek için plastik kutuların kenarları ve kapakları boyunca dört ila altı 0,25 santimetre delik yapmak. Vermikülit ve turba yosun yatak karışımı nemli bir karışımı ile kutuları doldurmadan önce bir oran bir. Yuvalama yerinde, yavaşça yumurta ortaya çıkarmak için toprak kaldırmak ve kuluçka sırasında mikrobiyal kontaminasyona karşı korumak için seyreltilmiş iyot tentürü ile her kaplumbağa yumurta yüzeyini silmek.
Kutu başına en fazla sekiz ila dokuz yumurtayı, tek tek debriyajları birbirinden ayrı tutarak, yatırıldığı gibi aynı oryantasyon ve hizada yerleştirin. Tüm yumurtalar toplandığında, yumurtaların yarısını yatak takımlarına elle gömün ve kapaklı kutuları sırasıyla 12, 13 ve 18 embriyoyu elde etmek için 10 ila 17 gün boyunca 30 derecelik bir kantinin içine yerleştirin. Dehidratasyon önlemek için yatak ortamı nı kısmen ıslatmak ve normal embriyo gelişimi için nem seviyesini korumak için damıtılmış su ekleyin.
Gelişimin uygun aşamasında, sırt yumurta kabuğu ve yumurta kabuğu nun bir tarafına bir kesim yapmak için sivri makası kullanın, yumurtanın uzun eksenine dikey. Daha sonra, kısa eksen boyunca yumurtanın diğer tarafını kesin ve embriyo tarafı yukarı ile excised parçası açmak soymak için çöyiş kullanın. Yumurta kabuğunun diğer yan tarafını kesin ve ekstremite parçasını PBS'ye yerleştirin.
Bir stereomikroskop ve forceps kullanarak, yumurta kabuğundan embriyo ve sarısı membran soyma. Ekstra embriyonik membranlar kaldırmak için çömetüler ve mikro makas kullanın ve taze PBS bir Petri kabına embriyo aktarmak için bir embriyo kaşığı kullanın. Herhangi bir kan ve sarısı yıkadıktan sonra, iki ila üç gün boyunca dört derece santigrat% 4 paraformaldehit içeren, 12-iyi plaka iyi başına üç embriyo kadar yerleştirin.
Örnekler beyaz göründüğünde, yıkama başına taze PBS üç beş dakika yıkar ile embriyoları durulayın polyester örgü dipleri ile polistiren ekler kullanın. Son yıkamadan sonra, konsantrasyon başına bir saat boyunca artan bir etanol serisi örnekleri dehydrate. İkinci etanol daldırma sonra, petri yemekleri kısmen kaplı daldırma başına 20 dakika boyunca etanol konsantrasyonları için HMDS bir dizi embriyokuru.
Sonra son bir 100% HMDS çözüm, tamamen veya kısmen bir duman başlık bir gecede kaplı embriyolar yerleştirin. HDMS konsantrasyonunu yavaş yavaş etanole artırarak yavaş kurutma, embriyolarda mükemmel bir yüzey yapısını ortaya çıkarmak için önemlidir. Ertesi sabah, tamamen kurutulmuş numuneleri standart alüminyum pim sapına dikkatlice monte etmek için çift çubukkarbon iletken bant kullanın.
Tüm numuneler monte edildiğinde, numuneleri 35 miliamperlik bir fışkırtmaya 60 ila 120 saniye boyunca çok ince bir altın filmi ile kaplamak için püskürtme kaplama odasına tanıtınız. Daha sonra, saplamaları ilgili dökme plakalarına monte etmek için set vidalarını güvenli bir şekilde sabitle. Örnek tutucuyu görüntüleme için taramalı elektron mikroskobunun örnek odasına aktarmak için örnek değişim aracını kullanın.
Taramalı elektron mikroskobu için yumurta kabukları hazırlamak için, herhangi bir sarısı veya albumin kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için embriyo hasadından sonra en az bir saat boyunca yumurta kabuklarını distile suya yerleştirin. Daha sonra, hava duman kaputunda hassas anti-statik mendiller üzerinde bir gecede temizlenmiş yumurta kabukları kuru. Kurutulmuş yumurta kabuklarını sayı ve embriyo aşamasına göre etiketlenmiş temiz numune şişelerinde saklayın.
Daha sonra, montaj, sputter ceket ve görüntü yumurta kabuğu örnekleri gibi sadece embriyolar için gösterdi. Slayt mantar kültürleri kurmak için, katı patates dekstroz agar yarım çeyrek inç blok kesmek için steril bir neşter kullanın ve tek tek cam mikroskop slaytlar üzerine blokları yerleştirin. Plaka ve slayt arasında yüzey gerilimi oluşturmak için onlardan slaytlar yükseltmek için temiz Petri yemeklerinin altına steril kürdan yerleştirin.
Petri çanak kürdan her slayt yerleştirin. Daha sonra, bir agar bloğunun dört yan tarafının her birine örnek inoculum mantarları aktarmak için steril bir döngü kullanın. Büyüyen mantarlar için nem sağlamak için slayt etrafında Petri kabına steril distile su birkaç damla ekleyin.
Plakayı kısmen parafin filmle kapatın ve mantar türleri için uygun kuluçka dönemi için plakayı 30 derece lik santigrat inkübatöre yerleştirin. Kuluçka sonunda, Petri kabından slayt kaldırmak ve dört derece santigrat bir gecede kuluçka için% 3 glutaraldehit bir konteyner için slayt sıkıca yapışmış agar blok aktarmak için steril forseps kullanın. Ertesi sabah, konsantrasyon başına 15 dakika boyunca artan bir etanol serisi örnekleri dehydrate.
%90 daldırma işleminden sonra, kritik nokta kurutma cihazının haznesine susuz kalan numuneleri yerleştirmeden önce tam bir doygunluk sağlamak için %100 etanolte iki 30 dakikalık değişiklikle son dehidratasyon için numuneleri işleyin. Hazneyi kapatın ve sıvı karbondioksitin içeri girmesine izin vermek ve sıvı karbondioksit odayı tamamen doldurana kadar etanolün dışarı çıkmasına izin vermek için vanaları açın. Daha sonra, oda basıncı inç kare başına basınç 1,000 pound aştığında kritik bir noktaya ulaşmak için hazneyi yavaşça ısıtın, sıcaklık 31 santigrat dereceyi aşar ve karbondioksitin sıvı ve gaz boşluğu dengededir.
Daha sonra, yüzey geriliminin numune üzerindeki herhangi bir etkisini önlemek için, depodaki karbondioksiti ve numuneyi gaz olarak yavaşça boşaltın ve mantar örneklerini gösterildiği gibi monte edin, plakalayın ve görüntüleyin. Bir aşama 12 boyalı kaplumbağa embriyoyanal tarama elektron mikrograf görünümü nasıl maksiller önem mandibular ötesine uzanır ve medially iyi işaretlenmiş burun çukuru sınırlar ortaya koymaktadır. Beş faringeal kemer de görülebilir.
Evre 15 embriyoda, yeni oluşan somitler embriyonun arka kuyruk bölgesinde görülebilir ve ön ekstremite tomurcukları ventrally'den daha kortal işaret eder. Bir carapace sırt iyi tanımlanmış bir büyüme de embriyonun tüm interlimb kanat bölgesi boyunca görselleştirilmiş olabilir. 18. aşamada, kısa bir zayıf tahmin burun üst gaga merkezi çentik sığar bir terminal kanca ile biraz ters alt gaga ile oluşmuştur.
Üst çene çentikli bir görünüm sergiler, ve küçük bir yumurta diş üst çene ucunda şekillendirme görülebilir. Elektron mikroskobu tarama ile Chrysemys picta yumurta kabuğu ve kabuk membran Ultrayapısal analizi, bir dış calcarinus yumurta kabuğu tabakası ortaya, sıkıca iç filamentöz kabuk membran bağlı. Yumurta kabuğunun dış yüzeyi, gruplar halinde ve bitişik kabuk üniteleri arasında düzenlenmiş küresel küresel nodüllerden yapılmış, küçük yuvarlak depresyonlar veya çeşitli boyutlarda gözeneklerin yoğunlaşmasıyla, iyi ayırt edilmiş mineralize kabuk ünitelerinden oluşur.
SEM. Benzersiz değişiklikler belirli bir doku tipleri için gerekli olan sem. Kimyasal ve hava kurutma yöntemi diğer organik numuneler için de kullanılabilir ve bağlantı slayt kültür tekniği tüm yumuşak, sağlam mikrobiyal kültürler için kullanılabilir.
