У нас есть стандартизированные протоколы подготовки образцов для визуализации окрашенных эмбрионов черепах, жесткой яичной скорлупы и грибковых культур с использованием сканирующей электронной микроскопии. Эти комплексные методы используют тонкие изменения в известных протоколах для обработки трех деликатных тканей, позволяющих дифференцировать исходные структуры и обрабатывать артефакты. Демонстрацией процедуры со мной будет Джессика Гиббонс, аспирантка из моей лаборатории.
Прежде чем собирать яйца черепах с поля во время гнездования, сделайте от четырех до шести отверстий 0,25 сантиметра по бокам пластиковых коробок и на их крышках, чтобы обеспечить аэрацию. Перед заполнением ящиков влажной смесью вермикулита и смеси постельных принадлежностей торфяного мха при соотношении один к одному. На месте гнездования аккуратно удалите почву, чтобы выявить яйца и протрите поверхность каждого яйца черепахи разбавленной настойкой йода для защиты от микробного загрязнения во время инкубации.
Поместите максимум восемь-девять яиц на коробку в той же ориентации и выравнивания, как они были заложены, сохраняя отдельные сцепления отдельно друг от друга. Когда все яйцеклетки были собраны, вручную похоронить яйца половину в постельных принадлежностях и место крышкой коробки внутри 30 градусов по Цельсию инкубатор в течение 10 до 17 дней, чтобы получить эмбриональные этапы 12, 13 и 18 эмбрионов соответственно. Добавить дистиллированной воды, чтобы частично мокрые постельные принадлежности среды через день, чтобы избежать обезвоживания, и для поддержания уровня влаги для нормального развития эмбриона.
На соответствующем этапе развития, используйте остроконечные ножницы, чтобы сделать разрез на одной стороне спинной яичной скорлупы и желтковой мембраны вместе, вертикальной к длинной оси яйца. Далее, вырезать другую сторону яйца вдоль короткой оси, и использовать типсы, чтобы очистить открытый выкачатый кусок с эмбрионом стороной вверх. Вырежьте другую боковую сторону яичной скорлупы и поместите вырезанный кусок скорлупы в PBS.
Используя стереомикроскоп и типсы, очистите эмбрион и желтковую мембрану от яичной скорлупы. Используйте типсы и микро-ножницы, чтобы удалить дополнительные эмбриональные мембраны, и использовать ложку эмбриона для передачи эмбриона в чашку Петри свежего PBS. После смывания крови и желтка, поместите до трех эмбрионов на колодец 12-хорошо пластины, содержащей 4%paraformaldehyde при четырех градусах по Цельсию в течение двух-трех дней.
Когда образцы появляются белые, используйте полистирол вставки с полиэфирной сетки днища для полоскания эмбрионов с трех пяти минут моет в свежем PBS за стирку. После последней стирки обезвоживают образцы в восходящей серии этанола в течение одного часа за концентрацию. После второго погружения этанола высушите эмбрионы в серии HMDS до концентрации этанола в течение 20 минут за погружение с частично покрытыми блюдами Петри.
Затем поместите эмбрионы в окончательный 100%HMDS раствор, полностью или частично покрытые дымом капот на ночь. Медленная сушка путем постепенного увеличения концентрации HDMS на этанол имеет важное значение для выявления отличной структуры поверхности в эмбрионах. На следующее утро используйте двойную палку углеродопроводяющей ленты, чтобы тщательно смонтировать полностью высушенные образцы на стандартной алюминиевой штырь заглушки.
Когда все образцы были установлены, ввести образцы в камеру распылитель, чтобы покрыть образцы с очень тонкой пленкой золота в течение 60 до 120 секунд на 35 миллиампер распыления. Затем надежно закрепите установленные винты, чтобы смонтировать заглушки на соответствующие пластины заливки. Используйте инструмент обмена образцами для передачи держателя образца в выборку камеры сканирующего электронного микроскопа для визуализации.
Чтобы подготовить яичную скорлупу для сканирования электронной микроскопии, поместите яичную скорлупу в дистиллированной воде, по крайней мере один час после сбора эмбриона, чтобы устранить любое загрязнение желтка или альбумин. Затем воздух высушит очищенную яичную скорлупу на тонких анти статических салфетках в дымовой капоте на ночь. Храните высушенную яичную скорлупу в чистых бутылках образца, помеченных номером и стадией эмбриона.
Затем, крепление, распыление пальто и изображение яичной скорлупы образцов, как только что продемонстрировали для эмбрионов. Чтобы установить слайд грибковых культур, использовать стерильный скальпель сократить от половины до трех кварталов дюйма твердого картофеля декстроза агар, и место блоков на отдельных стеклянных слайдов микроскопа. Поместите стерильные зубочистки на дно чистых чашек Петри для поднятия соскальзылок с них, чтобы создать поверхностное натяжение между пластиной и горкой.
Поместите каждый слайд на зубочистки в чашке Петри. Затем используйте стерильную петлю для переноса грибов из инокулума образца на каждую из четырех боковых сторон агар-блока. Добавьте несколько капель стерильной дистиллированной воды в чашку Петри вокруг горки, чтобы обеспечить влагу для растущих грибов.
Частично запечатать пластину парафиновой пленкой и поместить пластину в инкубатор 30 градусов по Цельсию для соответствующего инкубационный период для грибковых видов. В конце инкубации снимите слайд с чашки Петри и используйте стерильные типсы для переноса плотно прилипших агар-блока со слайда в контейнер 3%glutaraldehyde для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия. На следующее утро обезвоживать образцы в восходящей серии этанола в течение 15 минут за концентрацию.
После погружения на 90% обработать образцы для окончательного обезвоживания с двумя 30-минутными изменениями в 100% этанола, чтобы обеспечить полное насыщение перед размещением обезвоженных образцов в камере аппарата сушки критической точки. Печать камеры и открыть клапаны, чтобы жидкий углекислый газ, чтобы вентиляционные и пусть этанол жерл, пока жидкий углекислый газ полностью заполняет камеру. Далее, уплотнение и медленно нагревать камеру для достижения критической точки, когда давление камеры превышает 1000 фунтов давления на квадратный дюйм, температура превышает 31 градусов по Цельсию, и жидко-газовое пространство двуокиси углерода находится в равновесии.
Затем медленно слейте углекислый газ из камеры и образца в качестве газа, чтобы избежать каких-либо последствий поверхностного натяжения на образец, и монтировать, пластины, и изображение грибковых образцов, как попродемонстрировано. Боковое сканирование электронного микрографа зрения стадии 12 окрашены черепаха эмбриона показывает, как максимальная известность выходит за пределы мандалурной и medially ограничивает хорошо отмечены носовой ямы. Также можно наблюдать пять фарингальных арок.
На стадии 15 эмбрионов новообразованные сомиты видны в задней части хвоста эмбриона, а почки переделы более кортически, чем брюшной. Четко определенный результат плотоядного хребта также можно визуализировать по всей межлимбной области эмбриона. На стадии 18, короткий feebly проецирования морда сформировалась с слегка перевернутый нижний клюв с терминалом крюк, который вписывается в центральную выемку верхнего клюва.
Верхняя челюсть имеет зазубренный вид, и крошечный яичный зуб можно увидеть формирования на кончике верхней челюсти. Ультраструктурный анализ яичной скорлупы Chrysemys picta и мембраны оболочки путем сканирования электронной микроскопии, показывает внешний слой яичной скорлупы calcarinus, прочно прикрепленный к внутренней нити оболочки мембраны. Внешняя поверхность яичной скорлупы состоит из хорошо отличающихся минерализованных блоков оболочки из шаровых сферических узелков, расположенных группами и между соседними оболочками, с концентрацией небольших округлых впадий или пор различных размеров.
Общие методологии не могут быть обобщены для всех биологических образцов для достижения достойного качества изображения с использованием SEM. Уникальные изменения, как попродемонстрировано, имеют важное значение для конкретных типов тканей. Метод химической и воздушной сушки может также использоваться для других органических образцов, а метод культуры связи слайдов может использоваться для всех мягких и надежных микробных культур.
