Yaygın olarak kullanılan prob CFDA, ya da karboksifluorescein diasetat için kısa, non-floresan olduğunu. İki H3 grubu ve bu bileşiğin 3'6'pozisyonu membran-permeant hale getirir. Hücrelere girdikten sonra, iç hücresel asetatlar asetat gruplarını çıkaracak ve CFDA'nın yeni formunu serbest bırakacaktır.
Bu bir karboksifluorescein, ya da CF, floresan. Ve bu yeni form daha az membran permeant olduğu için, ağırlık, tüm hücreler hücreler arası gözenekleri, ya da bitkilerde plazmodesmata ile hareket etmektir, bu deasetat phloem aktivitesinde hücre içi taşıma çalışma için ideal bir sonda yapıyor. Bugünkü videoda, CFD yüklemesini arabidopsis bitkilerinin köküne ve hipokotiline doğru yükleyeceğiz ve iki farklı işlemin bu floresan sondanın alttan üste hareketini nasıl etkileyeceğini göstereceğiz.
Sürekli boyama sonuçları elde, biz dört santigrat derece hasat Arabidopsis tohumları saklamak, 40% nem kabine. Yedi günden fazla bu durumda saklanan yeni hasat edilen tohumlar ekim için kolayca kullanılır. Her bitki Petri çanak nispeten benzer bir alanda yetiştirilen sağlamak için, bir tohum bölge sınıf kartı kullanıyoruz.
Şimdi, sterilize ucu ıslatma, sterilize tohumları daldırma, ve belirlenen pozisyonda tohumları birer birer ekin. Ekim bittikten sonra, parafilm ve yapışkan bir bant ile Petri çanak mühür, dikey büyümesini sağlamak için bir Petri çanak standı üzerine koyun. İşte bu deneyde kullanacağımız araçlar.
Boyayı olabildiğince çabuk yüklememiz gerektiğini lütfen unutmayın. Normalde, 10 ila 15 dakika içinde tüm süreci bitirmek. CFDA yükleme deneyini gerçekleştirmeden önce her zaman taze CFDA çözümü hazırlıyoruz.
Burada, hemen kullanmadan önce su ile beş mikromolar konsantrasyoniçine bir milimolar CFDA seyreltin. Parafilm üç milimetre boyutunda küçük parçalar halinde kesin. Petri kabının kapağında ve altında yoğuşma olduğundan, boyanın akmasını önlemek için onları kağıt havlu ile temizlememiz gerekir.
Kökün altına küçük bir parafilm parçası konur. Bitkileri kaldırın ve kapağın üzerine koyun. Kökleri hipokotilin 5-10 milimetre altında kesin.
Küçük parafilm parçalarının çekimlerini geri alın. Şimdi dikkatle kök kesme ucuüzerine bir mikrolitre CFDA uygulayın. Tüm proto-bitkilerkontamine önlemek için deneyin.
Sonra kapağını kapatın ve iki saat boyunca büyüme odasında bırakın. Hipokodil pinching Yöntemi. Küçük parafilm parçası, daha önce hazırlandığı gibi, kök-hipokotil kavşak altına konur.
Hipokotili kök dokusuna yakın bir şekilde çimdiklemek için bir forecep kullanıyoruz ve 0.1 mikrolitre CFDA'yı sıkıştırılmış tarafa dikkatlice uygulayıp bitkiyi iki saat bekletiyoruz. Bölge boyama tesislerinden 9 ila 12 gün sonra fotoğraflar. Hepsi hem cotyledons ve gerçek yapraklarıvasküler boyama desen göstermektedir.
Sadece çok nadir bir durumda, cotyledon yaprağı yarım yaprak boyama deseni gösterdi. Yani temelde, iki yöntem CF boyama deseninde bir fark yaratmadı, ancak biz daha fazla bitki içine boya yükleme gerçekleştirmek, biz iki prosedür verimlilik önemli bir fark anlaşma vermek bulabilirsiniz. Kök kesme yöntemiyle, bitkilerin yaklaşık %70'i çekimde floresan sinyali gösterir.
Ama hipokotil pinching yöntemi ile verimlilik% 91 artırılabilir. Biz de kök sıkıştırma yöntemi denedim, ama bu yöntem daha düşük verimlilik sonuç, yaklaşık% 30 Bu nedenle, boya yüklemek için yol boyama farkı için hesap yok gibi görünüyor. Fark büyük olasılıkla bir symplastic bariyer ile ayrılmış olabilir yükleme siteleri, yatıyor.
CFDA'yı Arabidopsis köklerine ve hipokotillere nasıl yüklediğimizi gösterdik. Biz iki biraz farklı yordamlar kullanılan ve bu iki biraz farklı yordamlar üst prob hareketi bu alt önemli bir fark neden. Bu yöntemin, kökten türetilen ateş sinyalleri için potansiyel bir sempozyum bariyerini belirlememize yardımcı olabileceğini öneriyoruz.
